Rznomics 是一家韩国公司，聚焦 RNA 创新药物的研发，基于四膜虫Ⅰ型内含子的自剪接活性，开发了两大 RNA 技术平台：第一种称为 RNA Replacement Enzyme，基于反式核酶的 RNA 编辑平台；第二种称为 STS RNA 环化平台，利用反式核酶末端对末端的自我靶向和自我剪接反应（end-to-end self-targeting and splicing reaction）高效合成 circRNA。![]()
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通过两次连续的转酯反应，基于 I 型内含子的反式核酶（trans-splicing ribozyme）可利用治疗性目的 RNA 序列（末端连接 I 型内含子）替换掉原有靶标 RNA 序列（target RNA sequence）。反式核酶结构中的引导序列 IGS（5'-GN'N'N'N'N'-3'）与底物 RNA 上的靶标位点（5'-NNNNNU-3'）形成特殊的互补配对区(包含 G·U 摇摆配对)，即典型的 P1 螺旋结构，从而完成反式核酶对靶标位点的识别过程。核酶的 5’剪切位点由 P1 中的 G•U 配对界定。内含子 3’末端是一个保守的鸟苷酸ΩG，界定核酶的 3’剪接位点。位于核酶下游的目的 RNA 序列中的部分区域与引导序列 IGS 可形成部分配对，形成典型的 P10 结构。IGS 和靶标位点之间延伸的碱基配对可提升核酶反应的特异性和效率。P10 螺旋结构中接近 6~7 个碱基配对也可提升 3'剪接位点的特异性。在 I 型内含子核酶上游引入反义序列（antisense sequence），使其与底物 RNA 靶标位点下游区域（ABS）互补配对同样可提升剪接反应的特异性和效率。核酶的反式剪接反应发生两个独立的 RNA 分子之间。在第一次转酯反应中，外源鸟苷酸结合到位于核酶催化中心内的 G-Binding site，充当亲核基团，利用 3'-OH 攻击靶标位点，发生 5'剪接位点切割，导致靶标位点 3’末端的尿苷酸暴露出 3'-OH。在第二次转酯反应中，核酶构象首先发生改变，使得位于Ⅰ型内含子 3'末端的ωG 代替外源鸟苷酸结合到核酶催化中心。接着，靶标位点 3’末端暴露出 3'-OH 的尿苷酸会攻击ωG，把底物 RNA 与目的 RNA 序列连接起来。2
2023 年，Rznomics 公司研发团队 Seong-Wook Lee 等人在 Molecular Therapy : Nucleic Acids 发表文章：Efficient circular RNA engineering by end-to-end self-targeting and splicing reaction using Tetrahymena group I intron ribozyme，为利用四膜虫 I 型内含子产生 circRNA，他们设计开出一种 STS 环化载体，可在一个 RNA 分子内实现末端对末端的自我靶向和自我剪接以产生 circRNA。Rznomics 公司在 2022 年 10 月 12 日将 STS 环化技术申请专利：Construct of self-circularization RNA，专利号为 US11,939,580 B2。本期内容，我们将全面解析 STS 环化技术。![]()
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2.1
STS 自环化 RNA 载体序列设计如下：5’-IGS(引导序列)-ribozyme(核酶)–gene of interest(目的基因)-target site 3’(靶标位点)，其中，5’和 3’分别代表 RNA 载体的 5’末端和 3’末端，目的基因代表需要环化的 RNA 序列。需要注意的是，STS 自环化 RNA 载体序列根据 P1 Helix 长度和是否存在 P10 Helix 可分为2种类型：第一种是最为复杂的初始 STS 环化载体，具备延伸的 P1 Helix+P10 Helix，同时，为了将 P1 和 P10 拉近，分别在 IGS 上游添加反义序列 AS 和 target site 的下游添加与 AS 互补的 ABS 序列。![]()
初始 STS 环化载体设计原理
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初始 STS 环化载体质粒模板序列
第二种是优化后的 STS 环化载体只具有 P1 Helix，去除掉 P10 Helix 和 AS/ABS 序列。构成 G•U 摇摆配对的 U 位于 target site 的 3’末端，而构成 G•U 摇摆配对的 G 位于位于 IGS 序列的 5’末端。![]()
只具有 P1 Helix 的优化 STS 环化载体设计
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只具有 P1 Helix 的优化 STS 环化载体质粒模板序列
2.2
采用初始 STS 环化系统合成 circFluc(EMCV IRES)，测定不添加 GTP 直接环化（direct STS）和添加 GTP 诱导额外的环化反应对于环化效率的影响。将直接环化后的 RNA 样品用 RNasR 处理过后，在 4%聚丙烯酰胺尿素变性凝胶上，信号最为强烈的条带为 Candiate1（预测为 circRNA），此外还存在其他可清晰简单的条带（Candiate2 及 Nicked circRNA）。有意思是，在 IVT 结束后，添加 GTP 额外诱导环化反应（1st 和 2nd）产生的 RNA 样品经过 RNasR 处理过后，同样在凝胶上可见三条信号强度类似的条带。这说明无需额外的环化反应，IVT 反应过程中便可同步生成 circRNA。![]()
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接下来，研究需要验证迁移速度最为缓慢的 candidate 1 的确为 circRNA。将上述凝胶中的 candidate 1 回收，进行 RT-PCR。无论是否添加 RNase R，candidate 1 回收条带利用检测 circRNA 的引物均可扩增出条带，而不含核酶的线性 IVT RNA 产物均无法扩增出条带。这说明 candidate 1 毫无疑问肯定是 circRNA。将 candidate 1 RT-PCR 产物送去测序，结果证实 Luc 3’端和 IRES 5’端正确连接到一起。![]()
尽管采用 RT-PCR 证实 candidate 1 条带为 circRNA，但是无法排除 candidate 1 是一种通过分子间剪接反应形成的二聚体 circRNA。因此，采用 Nicking testing 再次进行确认。从电泳凝胶中回收到的 candidate 1/2 与不同浓度的 Mg2+离子混合，65℃条件下加热 30min，然后，立即冰浴。当不与 Mg2+离子孵育时，凝胶电泳条带上除了 candidate 1，还存在一个较弱的 Nicked circRNA 条带(1092nt)。当 Mg2+离子浓度为 2.5mM 时，凝胶电泳条带上的 candidate 1 条带基本消失，只可看到微弱的 Nicked circRNA 条带。当 Mg2+离子浓度提升至 5mM 时，即便是 Nicked circRNA 条带也将发生水解而消失不见。上述现象说明 candidate 1 是单体形式，在 Mg2+离子浓度为 2.5mM 时断裂为 Nicked circRNA（1092nt），Mg2+离子浓度为 5mM 时，完全降解。candidate 2 条带大小与完整的 precursor RNA（1847nt）类似。从电泳凝胶中回收到的 candidate 2 与与不同浓度的 Mg2+离子混合反应后再次电泳，结果发现，当 Mg2+离子浓度为 2.5mM 时，与 candidate 1 不同，candidate 2 并未产生 Nicked circRNA 条带，而是直接消失，说明 candidate 2 并非是 circRNA。![]()
此外，研究人员将胶回收的 candidate 1 与特异性 RNase H 探针（与 circRNA 环化连接处配对）退火，经过 RNase H 处理后的样品在电泳凝胶中显示两条带，与 RNase H 未处理组相比，circRNA 条带减少，Nicked circRNA 条带增加。再次证实 IVT 反应中的 precursor RNA 不可能发生分子间的自剪接反应生成多聚体 circRNA。
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2.3
研究人员将 STS 初始环化载体序列插入到以 CMV 作为启动子的质粒上，然后将该质粒转染至 293A 细胞。从转染后 12h 至 48h，细胞内 Luciferase 表达水平逐渐增加。从转染质粒 48h 后的 293A 细胞中提取总 RNA，采用 RT-PCR 和测序在分子水平证实细胞内确实生成 circFluc。![]()
2.4
为减少 circRNA 免疫原性，研究人员采用 IP-RP-HPLC 纯化 circRNA。HPLC 纯化系统为安捷伦 1290 Infinity 超高效液相色谱，分析柱为 Agilent PLRP-S 4000A。洗脱收集条件分为两种，一种用于样品的分析（Analytical）,一种用于样品的收集（Fraction collection）。![]()
用 HPLC 分析采用试剂盒小柱子纯化得到的 IVT 粗提产物，在峰图上可明显看到一前一后，两个间隔开来的峰，而一旦 IVT 产物经过 RNase-R 处理后，在 HPLC 峰图将只会留下前面的峰，后面的峰会消失。这说明 circRNA 位于前峰，线性 RNA 位于后峰，而且，还说明即便不使用 RNase R 处理，采用 HPLC 也可将 IVT 产物中的 circRNA 分离开来。![]()
采用 HPLC 的 Fraction collection 洗脱收集条件，分段回收样品，再用凝胶电泳检测回收到的样品。在凝胶电泳条带图中，我们可以非常清晰地看到在 Fraction 12 中存在纯度含量最高的 circRNA。![]()
2.5
在 STS 环化载体 DNA 模板上添加不同长度的反义序列/反义结合序列（AS/ABS）（50/100/150/200/250/300），研究 AS/ABS 序列长度对于 IVT 共环化反应（37℃+3h）效率的影响。![]()
凝胶电泳显示，与 AS200 或者更长的序列相比，AS50/100/AS150 显示出更好的环化效率。另外一方面，对于 AS50/100 来说。其 IVT 产物产量显著减少。因此，就环化效率和 IVT 产量来说，在在 STS 初始环化载体在添加 AS150 是最佳选择。IRES 和Ⅰ型内含子核酶都是高度结构化的，彼此之间可能会对各自的正确折叠造成影响，因此，在 IRES 和Ⅰ型内含子核酶之间添加 Spacer 序列是提升环化效率的常规做法。然而，对于基于 STS 环化体系来说，无论是添加 PolyA（A10/A30/A50）或者其他序列，对于环化效率和 IVT 产量来说均没有显著改变。![]()
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P1/P10/AS 元件对于 STS 环化效率影响研究人员设计了 3 种 STS 环化载体：包含 P1+P10+AS150 的 STS 环化载体；包含 P1+P10 的 STS 环化载体；仅包含 P1 的 STS 环化载体，旨在研究 circRNA 环化载体中 P1/P10/AS 元件对于 STS 环化效率的影响。IVT 共环化反应结束后，测定 IVT 产物含量和 circRNA 含量。结果发现，3 种 STS 环化载体的 IVT 产物产量无显著区别，然而，对于 circRNA 产量来说，P1+P10+AS 环化载体＞P1 环化载体＞P1+P10 环化载体。这个结果让人大感意外，也就是说在 STST 环化载体中，移除掉 P10 和 AS，仅仅保留 P1 也可通过 IVT 共环化反应高效产生 circRNA。![]()
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前面提到，在 STS 环化载体中去除掉移除掉 P10 和 AS，仅仅保留 P1 也可通过 IVT 共环化反应高效产生 circRNA。接着，研究人员想知道构成 P1 Helix 的碱基组成对于环化效率的影响。令人感到大为惊讶的是，凝胶电泳条带强度显示，富含 AU 的 P1 STS 环化载体环化效率要明显强于 P1+P10+AS/ABS 初始 STS 环化载体或者由其他碱基组成的 P1 STS 环化载体。![]()
2.6
研究人员将 PIE 和 STS 环化载体生成的 circGFP RNA 转染 293A 细胞，定点检测细胞内 GFP 蛋白表达水平。结果发现，STS 环化载体生成的 circRNA 在细胞内的蛋白表达水平要明显高于 PIE 环化载体生成的 circRNA。此外，研究人员还发现经 IP-RP HPLC 纯化的 circRNA 在 A549 细胞中几乎不会触发明显的天然免疫反应。![]()
小结
韩国 Rznomics 公司利用四膜虫 I 型内含子核酶设计了一种末端对末端自我靶向识别和自我剪接的 STS 环化载体系统，并且对其各元件进行优化，最终惊人地发现仅需 P1 Helix 便可高效生成 circRNA，此外，还发现构成 P1 Helix 的碱基富含 AU 时要比其他碱基具备更高的环化效率。当 P1 STS 环化载体仅包含 IGS，ribozyme，GOI 序列时，在 GOI 3’末端添加 U，那么生成的 circRNA 将仅由 GOI 和额外添加的 U 组成。如果将 GOI 中任何富含 AU 的区域选为 P1 Helix 中的 target site，将紧随 target site 后面的 3’-GOI 序列置于核酶ΩG 后面，那么最终生成的 circRNA 将仅仅由 GOI 组成，不包含额外的 U 碱基。总之，这种基于四膜虫 I 型内含子核酶的 STS 环化载体系统为高效生成 circRNA 提供了更多的选择性。
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