麦克实验室在脂质纳米颗粒（LNP）工艺开发方面（制剂配方和微流控工艺优化）做出非常多的贡献。最近，其门下弟子又整活了：为了更好地提升基于mRNA-LNP技术平台的基因编辑药物的递送效率和编辑效果，对包封Cas9 mRNA的脂质纳米颗粒配方和制备工艺展开优化，相关研究成功发表在Lab on a Chip：Optimized microfluidic formulation and organic excipients for improved lipid nanoparticle mediated genome editing.这工作非常有意义，一是以前极少人专门研究脂质纳米颗粒各组分和制备工艺对Cas9 mRNA介导的基因编辑效果的影响，二是，对CMC从业者来说，这是一份脂质纳米颗粒工艺开发的上好模板。
老麦克以胎儿肝脏靶向性的C14–494为固定阳离子脂质，分别研究微流控流速、磷脂、胆固醇、PEG脂质及组合配方的变化对脂质纳米颗粒理化特性（粒径、PDI、电位及包封率）和基因编辑效率的影响。
微流控总流速
固定LNP各组分和比例不变，保持水相和有机相之间的流速比为3:1，改变微流控总流速：0.3mL/min~3.6mL/min。
制备GFP mRNA LNP（996nt）时，在上述给定范围内提升流速，粒径和PDI会随之发生减小，包封效率略微有所增加，然而，这些LNP理化特性的改善对GFP mRNA LNP转染HepG2细胞的效率并无显著提升。
相比GFP mRNA，Cas9 mRNA(4522nt)要长得多。在总流速为0.3mL/min时，制备的Cas9 mRNA+sgRNALNP粒径大（300nm），异质性高（0.3 PDI），包封率不足80%。随着总流速从0.3mL/min增加至3.6mL/min，Cas9 mRNA+sgRNALNP粒径、PDI及包封效率均得到改善，并且，在总流速为2.4mL/min，HepG2-GFP 细胞编辑效率达到最高点。当总流速提高到3.6mL/min，HepG2-GFP 细胞编辑效率反而发生下降。
磷脂
磷脂酰胆碱（PC）极性头部含有胆碱基团，磷脂酰乙醇胺（PE）的极性头部含有乙醇胺基团。DOPE是具有不饱和脂质尾部的PE磷脂，DSPC是具有饱和脂质尾部的PC磷脂，DOPC和SOPC是具有不饱和脂质尾部的PC磷脂。制备包封Cas9 mRNA LNP，保持其他组分不变，采用用DSPC、DOPC 或 SOPC 替代DOPE，无论是从LNP理化特异性还是基因编辑效果来看，DOPE是最佳的磷脂选择。在HepG2-GFP细胞中，DOPE LNPs和DSPC LNPs的基因编辑效率可达15%，而DOPC 和 SOPC LNP基因编辑效率仅达到8%。此外，对于PC磷脂来说，随着脂质尾部饱和度的增加（DOPC → SOPC → DSPC），LNP理化特性和介导的基因编辑效率均得到提升。
胆固醇
保持LNP其他成分和比例不变，用菜油甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇替代胆固醇。与胆固醇相比，在HepG2-GFP细胞中，豆甾醇LNP介导的基因编辑效率可提升2倍。然而，所有三种胆固醇类似物的LNPs（∼140nm）的大小都比原始胆固醇制剂（70nm）增加了一倍，包封效率略微降低。
脂质-PEG
保持LNP其他成分和比例不变，分别用DSPE-PEG、DMG-PEG（BNT162b2制剂成分）及DTA-PEG（mRNA1273制剂成分）替换DMPE-PEG。4种PEG-脂质制备的脂质纳米颗粒的粒径、PDI及包封效率无非常明显的差异，只是涂有DMG-PEG和DTA-PEG的LNPs比DMPE-PEG和DSPE-PEG LNPs具有更多的正表面zeta电位。在HepG2-GFP细胞中，DTA-PEG LNPs介导的基因编辑效率最高。
组合配方
在上述筛选结果的基础上，研究人员分别选择效果最后的两种成分：磷脂（DOPE 和 DSPC）、胆固醇类似物（豆甾烷醇和β-谷甾醇）和脂质-PEG（DMG-PEG 和 DTA-PEG），可电离脂质为C14-494，制备包封Cas9 mRNA的LNP，从体外细胞水平基因编辑效率结果，筛选出效果最好的4种配方。然后，用MC3和原始组作为对照，重新配制LNP，包封SpCas9 mRNA+ TTR sgRNA，尾静脉注射小鼠体内，结果发现R4 配方制备的LNP介导的小鼠体内基因编辑效率最高。
小结
这项研究评估了微流控设备流速和C14–494 LNP其他脂质成分对于其包封的SpCas9 mRNA+sgRNA介导的基因编辑效率的影响。与原始 LNP 制剂相比，研究人员筛选出的R4 配方（C14-494、DOPE 、β-谷甾醇及DTA-PEG）组成的LNP能够在小鼠体内发挥出最佳的肝脏基因编辑效率。
