论文的研究目标、解决的问题及其意义
本论文在2024年10月2日在线发表于Nature。主要研究目标是通过直接向真菌细胞中注射细菌,人工诱导产生新的内共生关系,并跟踪观察内共生建立的早期过程和命运。内共生广泛存在于自然界,在生物进化和多样性形成中发挥着重要作用。然而,由于新内共生关系的出现概率极低且难以在自然条件下捕捉到,其形成机制仍不明确。本研究试图通过人工干预的方式,在可控条件下重现内共生产生的关键事件,揭示促进或阻碍内共生形成的因素,为理解这一重要生物学过程提供新的视角。
Here we implant bacteria into the filamentous fungus Rhizopus microsporus to follow the fate of artificially induced endosymbioses.
此外,作者选择小孢根霉属真菌作为宿主,将其天然内共生菌根霉生菌和大肠杆菌分别注射进入小孢根霉华的胞质中,试图为小孢根霉华引入新的代谢能力(如根毒素的生物合成),或赋予大肠杆菌在真菌体内生存繁殖的能力。这种人工内共生体系的构建,不仅可以加深人们对内共生的认识,更有望为合成生物学研究提供新的思路,帮助人们设计和创造具有特定代谢途径或功能的"设计型内共生体"。
Here we implant bacteria into the filamentous fungus Rhizopus microsporus to follow the fate of artificially induced endosymbioses. Whereas Escherichia coli implanted into the cytosol induced septum formation, effectively halting endosymbiogenesis, Mycetohabitans rhizoxinica was transmitted vertically to the progeny at a low frequency.
The production of rhizoxin by strain NH demonstrates that metabolic capabilities can be transferred to new organisms by artificially inducing an endosymbiosis through implantation and subsequent selection.
论文提出的新思路、方法及其特点
本研究的最大创新点在于,提出了一种将细菌直接注射进真菌细胞的方法,使得人们可以在可控条件下诱导内共生的建立。过去对内共生的研究主要局限于对已建立内共生关系的生物体系进行观察和分析,很难捕捉到内共生形成的早期过程。而本论文利用**流体力显微镜(FluidFM)**技术,通过在探针尖端开发一种双尖设计,成功克服了真菌细胞壁的高度硬度和高渗透压等障碍,实现了活细菌向真菌细胞的可控注射(每次约1-30个细菌),并结合共聚焦显微成像和荧光标记,实时跟踪内共生菌在宿主细胞内的生长、扩散和垂直传播的动态过程。
Here we have developed an experimental system that allows real-time investigation of the initial steps in the association of a fungal host with an intracellular bacterium.
Applying this technique to fungi is challenging owing to the complexity of fungal mycelia, the rigid cell wall and high turgor pressure. In this work, we report a procedure to implant bacteria into R. microsporus that enabled real-time tracking using confocal microscopy and characterizing early adaptations in the endosymbiosis under stabilizing selection pressure.
此外,研究者还利用**荧光激活细胞分选(FACS)**技术,从注射菌株后代孢子中高通量筛选含有内共生菌的孢子,并在严格筛选压力下连续传代培养,实现了人工内共生体系的稳定遗传和适应性演化。通过对比注射前后菌株的表型变化和基因组序列,揭示了宿主真菌适应内共生的遗传机制。
By round 7, the fitness index had increased from the initial 0.0006% to up to 8.7% with an average of 4.4%. The average fitness index in round 10 reached 14.0%, with the highest value noted for line 4 at 25.3%.
本研究建立的内共生菌注射和高通量筛选平台,为在体研究内共生的建立机制提供了有力工具,也为人工构建新型内共生体系探索了可行路径。作者还讨论了利用该方法向宿主引入特定代谢途径(如根毒素合成)的潜力,展现了其在合成生物学领域的应用前景。
利用FluidFM技术实现细菌向真菌宿主的可控注射和实时观察
本研究的一个关键创新是建立了一种利用**流体力显微镜(FluidFM)**将细菌直接注射入真菌细胞的方法。研究者成功克服了真菌细胞壁的高度硬度和高渗透压等技术障碍,通过在探针尖端设计一种新颖的双尖结构,实现了对真菌细胞的可控穿刺和活细菌的精准注射,每次可引入1-30个细菌。
Applying this technique to fungi is challenging owing to the complexity of fungal mycelia, the rigid cell wall and high turgor pressure. In this work, we report a procedure to implant bacteria into R. microsporus that enabled real-time tracking using confocal microscopy and characterizing early adaptations in the endosymbiosis under stabilizing selection pressure.
图1
图1展示了细菌注射的关键步骤和相关参数优化。研究者先利用聚焦离子束雕刻技术将探针尖端加工成双尖结构,然后在真菌孢子萌发的early germling阶段进行注射。通过在探针中加载荧光标记的细菌,并利用共聚焦显微镜成像,可实现对细菌在真菌细胞内动态分布的实时观察和跟踪(图1)。这为研究内共生的建立过程提供了前所未有的时空分辨能力。
人工诱导的大肠杆菌-根霉内共生体系未能实现垂直传播
利用上述FluidFM技术,作者首先尝试将大肠杆菌和根霉生菌分别注射入小孢根霉(Rhizopus microsporus)的EH和NH两个宿主菌株。结果显示,尽管大肠杆菌能在宿主细胞质中快速生长,但很快在局部形成高密度菌斑,引发宿主产生隔离性隔膜,最终未能进入孢子实现垂直传播(图2a,补充视频5/6)。这说明宿主-细菌互作的相容性是建立稳定内共生所必需的。
E. coli proliferated more rapidly within the hyphae, dividing bacteria generally stayed together, and the resulting bacterial clumps dispersed only slowly, following the cytoplasmic bulk flow within hyphae (Supplementary Videos 5 and 6). Combined, these dynamics led to the emergence of local hotspots with high bacterial density. The fungi formed septa around these densely populated areas, resulting in compartments with and without E. coli.
图2
根霉生菌能在非宿主真菌中实现垂直传播
与大肠杆菌不同,根霉生菌不仅能在其天然宿主EH中稳定生长和传播,在非宿主NH中也表现出类似的胞内定殖和孢子传播能力(图2b-e,补充视频7/8),尽管频率较天然宿主略低。分选实验证实,约4%的NH孢子携带有注射的根霉生菌并能产生内含细菌的子代(图2c,扩展数据表1),这是首次人工诱导获得的真菌-细菌内共生体系。
The experiment was carried out four times with similar results. c, Flow cytometry plots for spores collected from R. microsporus strain NH after no bacteria injection (top), E. coli injection (middle) and M. rhizoxinica injection (bottom). After injection with M. rhizoxinica, a high-GFP-signal fraction is observed (dashed grey rectangle), stemming from labelled bacteria.
适应性演化使人工内共生体系获得了显著增强的遗传稳定性
为进一步提高人工诱导的NH-根霉生菌内共生体系的遗传稳定性,作者开展了长达10轮的适应性实验室进化试验。利用荧光激活细胞分选技术(FACS)从每轮孢子中富集携带内共生菌的阳性孢子,分别测定阳性孢子的比例和发芽率,并定义二者乘积为内共生体系的"适合度指数"。结果显示,经10轮筛选和传代后,第10轮孢子的平均阳性率已从起始的0.01%提升至24.1%,发芽率也从6.3%恢复到75%(图3,扩展数据图1),使适合度指数平均达到14%,最高系中达25.3%(图3c,d)。交叉注射实验证实,宿主基因组的适应性突变可能是稳定内共生的关键(图4/5,扩展数据图2-4)。
By round 7, the fitness index had increased from the initial 0.0006% to up to 8.7% with an average of 4.4% (Fig. 3d). The average fitness index in round 10 reached 14.0%, with the highest value noted for line 4 at 25.3%.
图3
图4
图5
非宿主获得了内共生菌介导的代谢新能力
LC-MS/MS分析发现,携带根霉生菌的NH孢子能合成WF-1360F和rhizoxin等根霉毒素类化合物(图3f,g),而正常NH菌株不产生这些次生代谢产物。这证实了宿主真菌通过人工内共生获得了新的代谢能力。
The detection of rhizoxin validates the transfer of a metabolic trait to strain NH, which does not naturally generate the natural product.
小结
综上,本研究利用FluidFM技术建立了一种将细菌注入真菌细胞的新方法,并通过对人工诱导的NH-根霉生菌内共生体系进行长期适应性实验室进化,显著提高了内共生的遗传稳定性,使非宿主获得了内共生菌介导的代谢新能力。这些发现为揭示内共生的起源和演化机制提供了新的研究范式,也为利用内共生机制在非天然宿主中重构和优化生物合成途径开辟了新思路。
论文成果的影响及潜在应用
本论文建立的细菌-真菌人工内共生体系,为深入理解内共生的起源和进化机制提供了新的研究范式。通过直接向宿主细胞质内引入内共生菌,并在人为选择压力下驱动适应性演化,这种方法使人们能在实验室内重现和操纵内共生的关键环节,揭示宿主-共生菌互作的分子机制和促进内共生稳定遗传的遗传因素,拓展了人们对内共生形成机制的认知。
The direct implantation allows monitoring of the immediate reactions of pairs with varying degrees of preadaptation, and decoupled from hyphal entry.
此外,本研究还展示了通过人工内共生向宿主引入新代谢途径(如根霉毒素合成)的可能性,这对合成生物学研究和应用具有重要启示意义。利用类似策略,人们有望设计和构建具备特定生物合成能力的"设计型内共生体",在农业、医药、能源等领域得到应用,如创制新型生物农药、开发活体治疗用益生菌,以及利用内共生菌强化微生物电池性能等。
Our findings indicate that M. rhizoxinica is largely compatible with non-host R. microsporus strain NH, but maintaining the endosymbiont requires selection pressure. In the natural endosymbiotic pair, the costs for harbouring the bacterium are probably offset by benefits to the fungus, such as co-production of rhizoxin. We found that the implanted bacterium produced WF-1360F within R. microsporus strain NH. We also detected rhizoxin, which is produced when R. microsporus epoxidizes WF-1360F congeners, indicating that the ability to modify WF-1360F is not exclusively present in R. microsporus strains that evolved to harbour M. rhizoxinica.
未来研究方向及可能催生的机会
本研究虽然率先实现了细菌向真菌细胞的可控注射和人工内共生体系的适应性演化,但仍有许多问题有待进一步探索:
宿主-共生菌互作的分子机制。未来研究需进一步阐明宿主如何调控内共生菌的增殖和空间分布,内共生菌又如何规避宿主免疫、主动进入孢子确保垂直传播,双方互作的具体分子通路和关键基因有哪些,以使人们能更精准地设计和优化人工内共生体系。
遗传改造提高内共生体系的稳定性。目前人工获得的内共生体系大都缺乏竞争力,如何通过基因编辑和代谢工程等手段,从宿主/共生菌水平强化二者的互利共生,将有助于创制更稳健、可控的人工内共生体系。
拓展宿主-共生菌的适配范围。除本研究涉及的细菌-丝状真菌模式外,未来还可探索将该方法拓展至酵母菌、植物和动物细胞等其他宿主,并尝试引入兰藻、放线菌等非细菌共生者,以获得具有更多样合成能力的共生体系。
优化人工内共生体系的代谢能力。利用合成生物学工具对内共生菌进行代谢工程改造,赋予其产生更多目标天然产物、降解环境污染物、固定二氧化碳等能力,从而创制用于医药生产、环境修复、应对气候变化等用途的高效内共生"细胞工厂"。
Critical Thinking
样本量偏少。目前实验仅涉及2个真菌菌株(EH和NH)和2种细菌(大肠杆菌和根霉生菌),且获得稳定遗传的内共生系统仅1例,结论的普适性有待更多案例支持。后续研究需拓展宿主和共生菌的种类,以验证该方法的适用范围。
缺乏机制解析。尽管作者比较了进化前后菌株的基因组,并推测了一些可能影响共生稳定性的宿主基因功能,但尚未对关键基因进行功能验证。此外,根霉生菌能否通过主动入侵孢子实现垂直传播,背后的分子机制仍不清楚,有待深入研究。
人工内共生体系的竞争力和稳定性仍有待提高。实验演化获得的内共生菌株在无选择压力下仍会逐渐丢失内共生菌,且共生毒力及代谢能力与天然内共生体系尚有差距,如何进一步优化内共生互作、强化共生体系的竞争优势是亟待解决的关键问题。
人工水平转移内共生菌的长期生态风险有待评估。一旦人工内共生菌株被释放到自然环境中,是否会出现适应性进化,使其获得更广泛的宿主范围?这种"外来"内共生菌会给土著微生物区系带来什么影响?这些问题对于人工内共生体系在开放环境中的应用至关重要,还需要长期的生态学跟踪和风险评估。
宿主-内共生菌互作的代谢整合机制有待进一步阐明。本研究虽然初步实现了根毒素合成途径向新宿主的移植,但代谢网络的plug-and-play并非易事。内共生菌和宿主的原初代谢如何协同优化,双方如何建立高效的能量与物质交换,这些都是设计高效"人造内共生体"需要攻克的科学问题。
Our findings indicate that M. rhizoxinica is largely compatible with non-host R. microsporus strain NH, but maintaining the endosymbiont requires selection pressure. In the natural endosymbiotic pair, the costs for harbouring the bacterium are probably offset by benefits to the fungus, such as co-production of rhizoxin. We found that the implanted bacterium produced WF-1360F within R. microsporus strain NH. We also detected rhizoxin, which is produced when R. microsporus epoxidizes WF-1360F congeners, indicating that the ability to modify WF-1360F is not exclusively present in R. microsporus strains that evolved to harbour M. rhizoxinica. The production of rhizoxin by strain NH demonstrates that metabolic capabilities can be transferred to new organisms by artificially inducing an endosymbiosis through implantation and subsequent selection.
Biosyn导师：Julia A. Vorholt https://biol.ethz.ch/en/the-department/people/person-detail.MTM2MDU2.TGlzdC80NjAsOTIzMDMxMjIy.html#:~:text=Julia%20Vorholt%20was%20appointed%20Associate
Julia A. Vorholt是瑞士苏黎世联邦理工学院(ETH Zurich)微生物学的全职教授,领导着一个在微生物研究领域享有盛誉的课题组。
Julia教授的学术之路始于德国,她先后在波恩大学和马尔堡大学完成了生物学本科和硕士学位,并在马尔堡的马克斯普朗克陆地微生物研究所获得博士学位。她的博士论文因出色的工作获得了德国普通与应用微生物学会(VAAM)的论文奖。
在完成博士学位后,Julia作为博士后在美国华盛顿大学和法国图卢兹的CNRS实验室工作,并很快在马克斯普朗克学会开始了独立的课题组生涯。2006年,她作为微生物学副教授加入ETH Zurich,并于2012年晋升为正教授。
Julia教授在微生物学领域取得了一系列重要成就,尤其是在微生物-宿主互作和共生方面的开创性工作。她先后获得了欧洲分子生物学组织(EMBO)、德国国家科学院Leopoldina以及欧洲微生物学院(EAM)的会员资格。2015年和2020年,她还先后获得了欧洲研究理事会(ERC)的两项Advanced Grant,资助她开展关于微生物-宿主互作的前沿研究。2024年,她更是入选美国国家科学院(NAS),成为海外院士。
除了研究工作,Julia教授还担任瑞士国家微生物组研究中心(NCCR Microbiomes)的联合主任,积极推动微生物组学研究的发展。她还主持了ETH生物系的教学改革,参与多个跨学科研究中心的管理工作。在国际学术界,Julia教授是多个微生物学学会的董事会成员,包括国际微生物生态学会(ISME)和国际分子植物微生物互作学会(MPMI)等。
