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自1992年一氧化氮被评为“年度分子”以来，有关该生物分子的科学和临床发现不断扩大。目前，增强内源性一氧化氮的释放或外源性化合物的直接递送的疗法被认为是多种疾病中有价值的药物治疗。具体地，吸入一氧化氮的施用常规用于治疗患有肺动脉高压或难治性低氧血症的患者。最近，吸入一氧化氮已被研究为一种有前景的抗菌治疗策略，可针对一系列病原体，包括呼吸系统的耐药细菌和真菌感染。临床前和临床研究结果表明，剂量大于160 ppm时，一氧化氮具有抗菌特性，可用于杀死多种传染性微生物。本综述重点关注吸入高剂量一氧化氮作为肺部感染创新抗菌疗法的作用机制以及来自体外研究、动物模型和人体临床试验的最新证据。关键词：一氧化氮；吸入一氧化氮给药；抗菌作用；抗病毒作用；肺部感染
一氧化氮 (NO) 是一种由体内多种细胞类型产生的内源性自由基气体，在神经传递、血管舒张、抑制血小板活化以及白细胞粘附等过程中的细胞信号传导中具有多种重要的直接或间接生物学作用。宿主防御。由于这些特性，增强内源性NO释放或直接递送外源性NO的疗法已被开发用于治疗多种疾病。特别是，鉴于NO能够通过生物体液和脂膜快速扩散，因此已在呼吸系统疾病的治疗中研究了其通过吸入的递送。在临床实践中，吸入一氧化氮（iNO）目前被用作选择性肺血管扩张剂，以减少严重右心衰竭患者的右心室后负荷。它还用于减少因急性呼吸窘迫综合征或肺移植后难治性低氧血症患者的肺通气-灌注不匹配。这种对肺循环的选择性血管舒张作用是通过提供百万分之10～80剂量的iNO来实现的。当剂量大于160 ppm时，iNO被描述为具有抗菌特性，可用于杀死多种传染性生物体，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-冠状病毒-2）。这些发现导致大流行期间越来越多的研究旨在探索iNO的治疗性抗菌用途。这篇叙述性综述的重点是大剂量iNO作为肺部感染抗菌疗法的作用机制和当前用途。
NO是一种自由基和细胞信号分子，由一氧化氮合酶 (NOS) 从氨基酸L-精氨酸的氮基团合成。这种酶的几种亚型已被表征。尽管同种型催化相同的反应，但它们在NO产生的调节、幅度和持续时间以及细胞和组织分布方面有所不同。这些亚型通常分为组成型或诱导型。组成型一氧化氮合酶 (cNOS) 具有钙依赖性，可在短时间内释放低浓度的一氧化氮，以响应受体或生理刺激。cNOS作为转导信号分子，是多种生理反应的基础。组成型包括介导内皮依赖性血管舒张反应的内皮N合酶（eNOS/NOS3）和神经元NO合酶（nNOS/NOS1）。另一种亚型是诱导型一氧化氮合酶 (iNOS/NOS2)，它会响应细胞因子和与感染相关的特定物质（如内毒素）而被激活。一旦激活并表达，iNOS就会长时间大量合成NO。该亚型不依赖于钙，但需要其他辅助因子才能发挥作用。iNOS已被证明有助于针对入侵微生物和肿瘤细胞的非特异性防御机制。这些NOS亚型也在呼吸系统中被鉴定为气道内源性NO的来源，例如肺内皮细胞、炎症细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和氮能神经中。
NO的活性和作用机制具有浓度依赖性。根据NOS酶不同亚型的表达，NO的内源产生分为两类。NO由cNOS异构体以低剂量（基础水平）合成，作为细胞信号生物分子，主要发挥调节血管张力的作用。大多数NO诱导的血管效应是由环磷酸鸟苷 (cGMP) 的释放介导的。环状单磷酸鸟苷是由NO激活可溶性鸟苷酸环化酶产生的，然后将鸟苷三磷酸酶转化为cGMP。基于这些机制，罗伯茨等假设吸入的NO的输送将允许其通过肺部扩散并选择性地舒张肺血管。他们的实验支持了这一假设，并在呼吸医学领域发表了一篇开创性的出版物。Warren Zapol、Jesse D. Roberts及其团队确实是颠覆人们对NO从剧毒气体到治疗分子的认知的先驱，现已获得FDA批准用于临床。他们是第一个提出iNO作为治疗近足月婴儿肺动脉高压的临床疗法。仅在美国就有超过 150,000 名婴儿从iNO中受益，超过350,000名成人和儿童因超说明书用途而接受iNO，包括治疗肺动脉高压、急性呼吸窘迫综合征和许多其他疾病。当由NOS (iNOS) 诱导型同工型合成时，NO的浓度非常高，比cNOS高10～100倍。一旦激活，iNOS会在数小时内产生持续高水平的NO。在这种情况下，高浓度的NO可以促进杀菌生化反应，参与宿主先天免疫反应的防御机制。先天免疫的两个重要抗菌系统是iNOS和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH) 氧化酶途径。虽然iNOS活性的产物是NO，但NADPH氧化酶会产生超氧化物 (O2- )。涉及NO和O2-的自发或催化反应会产生高反应性中间分子，例如H2O2、OH−、单线态氧、次氯酸、二氧化氮 (NO2 )、过氧亚硝酸盐 (ONOO− )、二氮三氧化二铁、二亚硝基铁络合物、亚硝基硫醇或硝酰基，被称为活性氮（RNS）和活性氧（ROS）。RNS和ROS具有不同的稳定性，具有复杂的生物学作用，可以同时存在，并且都是先天免疫抗菌活性的关键效应物。特别是，ROS和RNS可以与微生物细胞中的许多靶标相互作用，包括硫醇、金属中心、蛋白质酪氨酸、核苷酸碱基和脂质，导致微生物细胞损伤。因此，ROS和RNS可能最终通过涉及微生物DNA、RNA、蛋白质、脂质和膜的亚硝化、亚硝基化以及亚硝化和氧化损伤的机制来停止和抑制病原体复制。它们还可以干扰复制、呼吸链、抑制合成酶和DNA修复。图1概述了这些机制。图1. 活性氮物种抗菌作用的多个目标结构的示意图，可以杀死或阻止微生物的生长
注：NO：一氧化氮，RNS：活性氮物种。该图是通过BioRender.com创建的（2022年3月19日访问）尽管NO 可能同时攻击传染性病原体的多个结构，但仅破坏铁硫键 (Fe-S) 就足以产生强大的抗菌作用。RNS的抗菌作用已在多种生物体中得到证实，如真菌、寄生虫和细菌。相反，关于NO对抗病毒感染的作用，已有相互矛盾的结果报道。
对高浓度内源性NO抗菌作用的描述导致了研究高剂量外源性NO 潜在抗菌作用的研究的发展。体外研究的证据有助于一氧化氮抗菌作用的定义和表征。重要的是，可以在体外确定具有抗菌作用的NO的适当浓度，并随后在临床研究中采用。加法里等人确定了NO的最低有效抗菌剂量，表明体外连续暴露于剂量大于160 ppm的NO长达 6 h能够消除大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的菌落。低于160 ppm的NO剂量仅诱导抑菌作用，这似乎是剂量依赖性的 。这些发现在使用高剂量NO (200 ppm) 对多重耐药微生物菌株（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐药铜绿假单胞菌）的研究中得到证实。由于担心持续暴露于高剂量NO的潜在体内毒性，进行了体外研究以确定替代有效方案。有趣的是，每3.5 h间歇性输送高剂量 NO 30 min，总共15 h，杀菌效果得以保留。因此，需要延长总治疗持续时间才能达到与连续给药相同的抗菌效果（图2）。![]()
图 2
注：间歇性高剂量NO (A-C) 或连续高剂量NO (D-F) 治疗期间的细菌存活曲线。细菌每3.5 h间歇性接触高剂量NO (160 ppm) 30 min，总共15 h[(A-C) 三角形）或连续接触160 ppm NO[(D-F) 三角形]6 h，与使用医用空气处理的对照相比（方块）。(A, D)金黄色葡萄球菌；(B, E)铜绿假单胞菌（囊性纤维化临床菌株）；(C, F)大肠杆菌。经许可转载外源NO的抗菌作用也已在体外针对病毒进行了研究。NO供体、能够以所需浓度释放NO的化合物或NO合成底物（例如 L-精氨酸）已被证明可以抑制处于不同复制阶段的各种类型的病毒。据报道，对于某些DNA病毒（例如乙型肝炎和单纯疱疹）和某些RNA病毒（例如甲型流感、乙型流感和冠状病毒），NO诱导抑制病毒复制的证据。克罗恩等人进行了第一批使用NO供体报告NO抗病毒作用的研究之一。其他实验表明，NO诱导的三种不同类型的感染细胞（Vero、Hep2和RAW 264.7）中的HSV 1复制抑制呈剂量依赖性。在另一项体外研究中，在感染甲型流感 (A/Netherlands/202/95 [H3N2]) 或流感的Mabin Darby犬肾 (MDCK) 细胞中使用SNAP获得了类似的结果，表明NO诱导的病毒复制显著抑制。B(B/Netherlands/22/95) 病毒。使用浓度为400 μM的SNAP观察到最强的抑制作用 。进一步的实验还证明了以气态形式传递的NO的抗病毒功效。MDC细胞，感染三种不同流感病毒株之一（甲型流感病毒，A/Denver/1/19 57 (H1N1)、A/Victoria/3/75(H3N2) 和乙型流感病毒，B/香港/5/72），暴露于160 ppm的NO气体混合物中，连续输送长达2.5 h，并与被感染但仅暴露于空气的对照细胞进行比较。结果表明，在该模型中，NO能够显著抑制甲型流感病毒的感染性，但不能抑制乙型流感病毒。然而，当病毒体在感染前暴露于浓度80和160 ppm的NO 10～120 min时，所有三种病毒株的感染性均得到完全抑制（图3）。图3. NO对流感病毒的抑制作用
注：(A , D) H1N1, (B, E) H3N2 , (C, F) B 型流感。左图：汇合细胞以100 PFU/孔感染所示病毒，然后用160 ppm NO处理长达2.5 h（三角形）或医用空气作为对照（正方形）。通过空斑减少测定评估病毒感染性。右图：在感染前用80或160 ppm NO处理悬浮在生理盐水中的病毒粒子 (1000 PFU) 10～120 min（三角形）或医用空气作为对照（正方形）。处理结束时，使用悬浮液感染单层汇合细胞。通过噬菌斑减少测定来评估感染性。* 或 **P<0.05。经许可转载。重要的是，最近的实验证据证明NO也具有针对 SARS-CoV-2的体外抗病毒作用。SNAP作为NO供体以200 μM或400 μM的剂量给药，在感染SARS-CoV-2的 Vero E6细胞中诱导病毒复制的剂量依赖性抑制。然而，在该模型中，即使使用最高剂量的SNAP，病毒复制也没有完全消除。尽管如此，SNAP治疗减少或消除了病毒诱导的细胞病变效应。高剂量 iNO的抗菌和抗病毒作用已在一些动物实验模型中进行了研究。在由铜绿假单胞菌引起的大鼠肺炎模型中，每4 h间歇性施用160 ppm iNO 30 min，总共12或24 h ，耐受性良好，没有相关副作用，并且相比之下，肺部细菌菌落计数显著减少。在另一项研究中，为了研究iNO可能的剂量反应效应，小鼠接受肺炎克雷伯菌肺部感染，然后用 80、160或200 ppm的iNO连续治疗48 h，或用空气作为对照。在整个48 h的实验期间，另一个实验组每3 h间歇性地接受300 ppm iNO，持续12 min。与对照组相比，仅在接受300 ppm间歇性iNO的动物中观察到死亡率和肺和脾脏细菌计数显著降低。这些结果表明，剂量和暴露时间之间的正确平衡可能在iNO的抗菌效果中发挥重要作用。iNO的间歇和连续给药方案也在 C57B1/6 小鼠甲型流感感染的体内实验模型中进行了测试。然而，在该模型中，预防性（感染前1 h）或治疗性（感染后4 h）连续给予80 ppm iNO或每3.5 h给予160 ppm持续 30 min直至12 d，未能降低死亡率速度。此外，两种治疗方案均未能降低感染流感的小鼠肺部的病毒载量。高剂量NO作为一种潜在的抗菌疗法的临床应用已得到越来越多的研究。这些研究重点关注一氧化氮对肺部的影响，因为一氧化氮易于通过吸入途径选择性输送。由于其高反应性，高剂量iNO的肺部输送可能会导致不良的毒性作用。事实上，NO可以高亲和力快速结合血红蛋白，形成高铁血红蛋白 (metHb)。持续高水平的 metHb (>6%) 与向组织输送氧气 (O2) 不良有关。除了形成metHb 之外，高剂量的iNO 在与O2共同输送时还会产生有毒化合物，例如二氧化氮(NO2 )。为了解决这个问题，如前所述，研究人员探索了iNO给药方案，使用短时间间歇性高剂量（例如160 ppm，持续30 min），然后在治疗之间设置恢复窗口（至少3.5 h），以避免显著的副作用。高铁血红蛋白血症并减少潜在的毒性。米勒等进行了第一个人体临床研究来评估间歇方案的可行性和安全性。他们向健康成年志愿者提供 160 ppm的 iNO，每次30 min，每天5次，连续5 d。根据肺功能参数和血浆中测量的关键促炎细胞因子，没有证据表明存在肺损伤或气道炎症。同样，没有报告明显的不良事件，并且所有个体都耐受iNO治疗，证明了这种高剂量iNO给药方案的可行性和安全性。德普什等使用相同的间歇性高剂量iNO输送策略来治疗囊性纤维化 (CF) 患者的抗生素耐药性细菌和真菌肺部感染。这项研究证实了这种治疗的安全性，并证明高剂量 iNO显著降低了这些患者的肺部微生物负荷和炎症，从而改善了肺功能。然而，在 Deppish的研究中，间歇性高剂量iNO给药方案未能实现完全根除微生物，这表明在确定高剂量iNO体内抗菌策略的最佳剂量和治疗持续时间方面有很大的改进潜力。Bentur等人也得出了类似的结论。最近一项针对患有难治性脓肿分枝杆菌（非结核分枝杆菌-NTM）肺部感染的 CF 患者的初步研究。在这项研究中，间歇性输送160 ppm iNO总共21 d，仅导致肺部NTM的减少，而不是完全根除微生物。研究人员推测，未能实现根除可能是由于潜在的NO中和作用，这表明可能需要更长的iNO治疗时间才能实现根除杀菌活性。作者还假设，延长间歇性iNO治疗超过3周可能会增加 NTM生物膜对抗生素的敏感性，并提高CF气道的杀菌活性。然而，最近的病例报告表明，即使更长的持续时间（长达29 d）和更高剂量的iNO（高达 250 ppm）也无法诱导感染性微生物的根除。总体而言，尽管间歇给药策略的应用剂量和治疗持续时间存在很大差异，但上述临床试验中报道的外源性高剂量iNO的体内递送并未表现出与体外研究中观察到的相同显著抗菌效果。这些数据表明，新的研究应旨在证明高剂量iNO方案在体外有效的体内安全性和有效性，连续而不是间歇性给药以及延长而不是短的暴露时间。在表1中，我们总结了与抗菌高剂量NO治疗最相关的体外、体内和临床研究。表 1. 实验选择的抗菌高剂量一氧化氮输送方案
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几项研究还调查了iNO的抗病毒作用，并取得了有希望的结果。特别是，一项多中心随机试点临床试验测试了间歇性高剂量iNO给药对患有病毒性细支气管炎的住院婴儿的安全性和耐受性。每位患者接受间歇性高剂量 iNO (160 ppm) 加氧气/空气30 min，或单独接受氧气/空气（对照），每天5次，最多5 d。69名婴儿参加了这项研究。结果表明，间歇性iNO治疗耐受性良好，次要临床终点表明有益处 。然而，由于缺乏以患者为中心的结果作为主要终点的更大规模的临床试验，因此无法就该患者群体中的iNO治疗得出任何进一步的结论。最近，由于 SARS-CoV-2 大流行对卫生系统的巨大影响，几个病例系列报告了2019年冠状病毒病 (COVID-19) 患者使用iNO治疗的数据。在所有这些研究中，高剂量iNO (160～200 ppm) 采用间歇疗法，每次30 min，每天2次。总体而言，据报道，该治疗具有良好的耐受性，并且改善了氧合和心肺功能，没有毒性或不良事件的证据。然而，由于这些病例报告的观察性质以及接受高剂量iNO治疗的COVID-19患者总体数量较少，这些数据只是假设生成，但不足以表明任何临床益处。关于具有最高功效和最低毒性的方案的定义的重要问题仍然悬而未决。
为了优化治疗效果，我们的小组进行了多项实验研究，以调查以下假设：延长（6～12 h）连续而不是间歇性 iNO 输送的方案可能具有优异的抗菌效果。这些研究调查了该方案的安全性，因为 iNO 诱导的毒性可能增加，包括高铁血红蛋白和 NO2形成、血流动力学变化和血小板功能改变的较高风险。为了研究长时间（12 h）连续输送高剂量 iNO（200 ppm）是否可行且不会损害肺实质，将该方案应用于灌注和通气肺的离体模型。离体肺灌注（EVLP）是我们小组开发的一个新平台，它允许在隔离环境中将治疗药物输送到肺部（图4），从而消除对其他周围器官产生附带副作用的风险。过去十年来，它已在我们中心应用于临床，可以更客观地评估供体肺功能，从而成功地增加了供体肺移植的使用。图 4. 常温离体肺灌注 (EVLP) 平台的概念图和治疗策略的机会EVLP也被用于研究肺再生和改造的创新疗法，如表面活性剂替代、ABO抗原耗竭、α1抗胰蛋白酶给药、基因疗法、光动力疗法、紫外线C照射和高剂量抗生素。在多伦多EVLP平台中，肺部灌注无细胞溶液。因此，系统中没有血液提供了机会，可以研究NO和NO2对健康肺实质的纯孤立作用，并评估与高剂量iNO相关的任何潜在肺毒性，而与它对metHb形成的潜在影响无关。在猪EVLP模型中，我们证明连续12 h连续给予200 ppm高剂量iNO是可行的，并且不会引起肺损伤。在我们的研究中，健康的肺取自雄性约克夏猪（28～35 kg），用标准肺保存溶液冲洗，并使用多伦多 EVLP 技术放置在 EVLP 平台上。将肺随机分为两组（n=4/组）：(1) 对照组和 (2) 使用 200 ppm连续iNO治疗。监测肺损伤的生理和生物学指标12 h。我们发现重要的生理参数，如氧合、顺应性和气道压力保持稳定，并且与对照组相当。此外，肺组织学评估显示接受治疗的肺没有损伤的组织学证据。此外，与对照相比，iNO治疗没有诱导显著的炎症反应，如促炎细胞因子没有显著增加所表明的，如图5所示。图 5. 在离体肺灌注过程中使用连续抗菌剂量吸入一氧化氮的安全阶段研究的直观总结
注：ppm：百万分之一，NO：一氧化氮，iNO：吸入一氧化氮，NO2：二氧化氮，VT：潮气量，PEEP：呼气末正压，bpm：每分钟心跳次数，FiO2：分数吸入的氧气。该图是通过BioRender.com创建的（2022年3月19日访问）这是第一次长时间持续输送高剂量 NO，而没有出现毒性、炎症或肺部恶化的迹象。我们进一步研究了在体内大型动物模型中长时间持续输送高剂量iNO的安全性，以专门解决iNO诱导的潜在全身毒性和metHb 的形成。实验方案包括静脉注射亚甲蓝 (MB) 作为还原剂来治疗高铁血红蛋白血症，并将高铁血红蛋白的铁血红素重新转化为功能性亚铁态Hb。将约克夏猪注射镇静剂、机械通气并随机分为以下两组之一：(1) 对照组和 (2) 用连续 iNO 160 ppm + 亚甲蓝 (MB) 治疗，1 mg/Kg，作为静脉推注，无论何时需要维持metHb <6%。两组均持续通气6 h；然后，动物停止镇静和机械通气，并随访3 d。在治疗期间和术后第3天，进行了一系列评估以评估肺功能和潜在的肺部或全身损伤。在研究期间没有观察到肺功能或炎症标志物的显著变化。治疗动物和对照动物的气体交换、组织学和肺组织细胞因子相似。在给予iNO期间，每只接受治疗的动物中都观察到metHb水平升高（最高水平6.9%），然后通过MB治疗迅速降低。一剂MB足以维持metHb水平<6%。整个实验期间，NO2的水平始终低于安全阈值 (5 ppm)，平均水平为3.24 ± 0.35 ppm。血液生化标志物未观察到其他显著变化。我们的研究结果表明，在体内连续6 h输送 160 ppm iNO和佐剂MB是可行且安全的（图 6）。![]()
图 6. 使用亚甲蓝佐剂在体内安全输送高剂量一氧化氮的可行策略的直观总结
注：ppm：百万分之一，NO：一氧化氮，iNO：吸入一氧化氮，metHb：高铁血红蛋白，NO2：二氧化氮，MB：亚甲蓝，PC：压力控制，PEEP：呼气末正压，bpm：每分钟心跳次数，FiO2：吸入氧气的分数。该图是通过BioRender.com创建的（2022 年 6 月 22 日访问）尽管我们的体内研究并未关注 iNO 的抗菌作用，但它生成了临床前安全数据来设计一项试点临床试验 (NCT 04383002)，调查持续输送高剂量iNO作为抗菌疗法的功效，包括治疗COVID-19患者。这是特别及时的，因为过去两年已有多个中心启动了临床试验（NCT 04306393、03331445、04338828、04305457、04476992、04312243），研究高剂量iNO治疗COVID-19的可行性和有效性。然而，除了我们中心的试验外，所有其他研究的方案都是间歇性而非连续性地设计iNO。
iNO作为抗菌疗法的潜力引起了科学界和临床领域的极大兴趣。正如本综述所总结的，越来越多的证据表明，由于其显著的抗菌活性，高剂量iNO的输送可能是安全的，并且在治疗肺部感染方面可能具有有前景的临床治疗应用。出于多种原因，这种创新抗菌治疗策略的开发非常重要。首先，该策略利用新颖的作用机制来实现抗菌活性，不同于目前传统的抗生素药物。其次，iNO抗菌作用与微生物对传统治疗药物的耐药性无关，传统治疗药物的广泛使用导致潜在致命的多重耐药物种在全球范围内不断发展。第三，高剂量iNO治疗可能对多种病原体和多种微生物感染有效。此外，高剂量iNO对呼吸道病毒具有潜在的直接抗病毒作用，因此代表了病毒性肺部感染（包括 COVID-19）的治疗选择。未来的研究需要进一步阐明高剂量iNO的最佳治疗方案，以最大限度地发挥抗菌作用，同时最大限度地降低其潜在毒性。特别是，有关连续给药与间歇给药、有效抗菌药物剂量范围、给药时机和治疗持续时间等基本问题值得进行具体研究。此外，仍需要高质量的临床证据来最终确定高剂量iNO输送在改善呼吸系统感染患者预后方面的功效。
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