Nature | 单细胞与空间组学联合解析揭示炎症性单核细胞通过MHC-I交叉传递激活T细胞及其在肿瘤免疫治疗中的关键作用

肿瘤免疫疗法的成功依赖于效应T细胞的活化和肿瘤微环境（TME）的免疫激活。然而，尽管T细胞的初始活化主要发生在淋巴结，越来越多的证据表明，肿瘤内部的T细胞需要额外的局部再刺激（restimulation）才能发挥持久的抗肿瘤功能。这一过程通常在TME中的“免疫激活微区”（immune niches）内完成，这些微区由炎症性单核细胞、树突状细胞（DC）和T细胞共同构成。尽管传统观点认为抗原呈递主要由cDC1通过交叉呈递（cross-presentation）完成，近期研究暗示单核细胞可能在这一过程中发挥关键作用。与此同时，肿瘤细胞通过分泌抑制性因子（如PGE2）和调控信号通路（如MAPK通路）对TME进行重塑，从而削弱免疫激活微区的形成。I型干扰素（IFN-I）是促进免疫激活的关键因子，但其功能常在肿瘤中被显著抑制。目前仍未明确：

1. 单核细胞是否通过其他机制（如MHC-I交叉传递）在T细胞再刺激中起作用；
2. 肿瘤细胞通过何种具体机制阻碍这一过程；
3. 如何通过调控PGE2或恢复IFN-I信号来逆转肿瘤的免疫逃逸。

基于此，本研究通过系统解析炎症性单核细胞在T细胞再刺激中的作用，揭示肿瘤细胞如何通过PGE2和IFN-I的相互作用破坏这一免疫激活机制，并提出了优化免疫治疗的潜在策略。

• 使用YUMM1.7（Braf^V600E；Pten^-/-；Cdkn2a^-/-）小鼠黑色素瘤模型，建立未治疗肿瘤（NTT）和对MAPK抑制剂耐药的肿瘤（RTT）。

• 应用抗原特异性CD8⁺T细胞（OT-1Luc）进行过继性细胞转移（ACT）。

2. 技术

• 单细胞RNA测序（scRNA-seq）：分析肿瘤微环境中免疫细胞的构成及转录组特征。

• 多参数免疫荧光（IF）：评估单核细胞、DC和T细胞在肿瘤中的空间分布及相互作用。

• 功能实验：验证单核细胞的MHC-I交叉传递功能及其对T细胞的影响。

3. 遗传与药物干预

• 分子生物学手段：敲除肿瘤细胞中PGE2合成相关基因（Ptgs1/2），或通过过表达IFN-I调控因子（IRF3/7）恢复干扰素信号。

• 药物干预：结合PGE2抑制剂（如celecoxib）与免疫治疗评估疗效。

1. T细胞与单核细胞的空间分布与相互作用

1）NTT（初始未处理）和RTT（耐药）肿瘤微环境中免疫细胞组成的差异

• 单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析显示，在NTT肿瘤中，炎症性单核细胞占据主导地位，表达高水平的Ly6C2、CXCL9、CXCL10和IL15。

• 在RTT肿瘤中，炎症性单核细胞显著减少，免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAM）数量增多。

2）T细胞与炎症性单核细胞的共定位

• 免疫荧光（IF）分析显示，NTT肿瘤中，CD8⁺ T细胞与单核细胞在肿瘤边缘聚集，形成免疫激活微区，而RTT肿瘤中缺乏此类微区。

• 在NTT肿瘤中，T细胞更常与单核细胞而非树突状细胞（cDC1）直接接触。

• T细胞在NTT肿瘤中表现出高Nur77表达，表明T细胞受体（TCR）活化信号的存在。

• RTT肿瘤中的T细胞主要分布于肿瘤边缘且活化状态较低。

4）阻断实验验证

• 阻断T细胞从淋巴结迁出的实验（使用FTY720）表明，NTT肿瘤中的T细胞扩增主要由肿瘤局部的再刺激驱动，而非来自外周循环。

• scRNA-seq分析表明，NTT肿瘤中的单核细胞高表达抗原呈递相关基因（如MHC-I、MHC-II）和IL15。

• Ly6A⁺炎症性单核细胞在H2-Kb-SIINFEKL染色中显示肿瘤来源的MHC-I复合物，证明其通过交叉传递（cross-dressing）获取抗原。

2）功能验证实验

• 在体外实验中，NTT肿瘤中的Ly6A⁺单核细胞能够激活CD8⁺ T细胞（通过CFSE稀释实验验证）。

• 非炎症性单核细胞（Ly6A⁻）则无法激活T细胞。

3）交叉传递的肿瘤来源验证

• 在β2-微球蛋白缺失（B2m KO）模型中，单核细胞不再表现H2-Kb信号，说明交叉传递的MHC-I来源于肿瘤细胞。

• 进一步的功能实验表明，B2m KO模型中，T细胞扩增显著降低。

4）单核细胞与cDC1的相对作用

• 在Rag2⁻/⁻Batf3⁻/⁻小鼠（缺乏cDC1）中，NTT肿瘤仍能通过单核细胞介导T细胞扩增。

• 当B2m KO与Batf3⁻/⁻模型结合时，T细胞扩增完全丧失，表明单核细胞与cDC1在T细胞激活中的互补性作用。

3. PGE2与IFN-I信号调控的实验数据

1）RTT肿瘤中PGE2和IFN-I信号的改变

• RNA-seq分析显示，RTT肿瘤中PGE2生成通路（Ptgs1和Ptgs2）显著上调，而IFN-I信号相关基因（Irf7和Irf3）显著下调。

• ELISA实验验证了RTT肿瘤中PGE2浓度显著升高，而IFNβ水平显著降低。

2）PGE2对炎症性单核细胞的抑制

• PGE2通过影响Ly6C⁺单核细胞分化为Ly6A⁺炎症性单核细胞，削弱其抗原递呈能力。

• 在Ptgs1/2 KO（PGE2合成缺失）模型中，炎症性单核细胞数量恢复，T细胞浸润显著增强。

3）IFN-I信号的作用

• IFNβ过表达实验显示，恢复IFN-I信号可显著增加Ly6A⁺单核细胞数量，并提升T细胞活化状态。

• 基因功能分析表明，IFN-I信号激活了单核细胞的抗原呈递通路。

4）联合调控PGE2与IFN-I

• Ptgs1/2 KO和IRF3/7过表达的组合治疗能够显著提升肿瘤内T细胞扩增效果，即使在缺乏cDC1的条件下仍能发挥作用。

4. 药物联合治疗效果

1）PGE2抑制剂的效果

• Celecoxib（COX-2抑制剂）处理RTT肿瘤后，炎症性单核细胞和cDC1的数量显著增加，肿瘤体积明显缩小。

• 单独使用celecoxib仅能实现短期抑制，而与ACT联合使用时可完全控制肿瘤生长。

2）IFN-I信号恢复的作用

• 通过IRF3/7过表达恢复IFN-I信号后，TME中Ly6A⁺单核细胞显著增多，T细胞浸润率提高。

• IFN-I信号恢复与PGE2抑制协同作用明显，进一步增强了抗肿瘤效果。

3）组合治疗的优化

• celecoxib与DNA甲基转移酶抑制剂5-AZA联合治疗显著改善TME中单核细胞的炎症状态，增强T细胞功能。

• 组合治疗在短期内表现出更高的T细胞活化率，但需要持续治疗以维持疗效。

5. 肿瘤的免疫激活微区

1）CXCL9⁺CXCL10⁺单核细胞在肿瘤样本中的鉴定

• 在黑色素瘤和NSCLC样本中，通过scRNA-seq发现高表达CXCL9和CXCL10的单核细胞群，表现出显著的干扰素刺激基因（如ISG15和STAT1）表达。

2）空间转录组学验证

• 空间分布分析显示，CXCL9⁺CXCL10⁺单核细胞与活化的CD8⁺ T细胞共定位，形成免疫激活微区。

• 缺乏CXCL9⁺CXCL10⁺单核细胞的区域几乎没有T细胞分布。

3）功能性验证

• CXCL9⁺CXCL10⁺单核细胞的抗原递呈相关基因（如HLA-DRA）表达显著，表明其在吸引和激活T细胞方面的功能重要性。

• 炎症性单核细胞在肿瘤内部通过形成“免疫激活微区”帮助T细胞持续活化，而耐药肿瘤中这些细胞的减少导致T细胞功能受限。

2. 单核细胞的“交叉传递”机制

• 炎症性单核细胞通过从肿瘤细胞获取MHC-I复合物激活T细胞，而非依赖传统的抗原递呈方式。

3. 肿瘤抑制信号的破坏作用

• 耐药肿瘤通过PGE2上调和I型干扰素信号下调，抑制炎症性单核细胞的功能，破坏免疫激活过程。

4. 药物治疗的潜力

• PGE2抑制剂或I型干扰素信号恢复疗法能够重新激活单核细胞功能，增强T细胞活性，联合治疗在耐药性肿瘤中效果显著。

5. 人肿瘤样本中的验证

• 在人黑色素瘤和肺癌样本中发现了类似的炎症性单核细胞，证明该机制在人肿瘤中也适用，为免疫治疗提供了新靶点。