Nature Genetics | 基于单细胞和空间转录组学的非小细胞肺癌免疫化疗耐药性及肿瘤微环境特征研究

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的主要亚型，占肺癌病例的约85%。近年来，免疫检查点抑制剂（ICI）尤其是程序性死亡受体1（PD-1）和其配体（PD-L1）抑制剂已显著改善了部分晚期NSCLC患者的生存率。然而，临床数据显示，尽管ICB疗法在一定程度上重塑了肿瘤微环境（TME），约68%的患者仍表现出对ICB联合化疗的初始或继发耐药性。这种治疗耐药性主要与肿瘤细胞的异质性及其与TME的复杂相互作用有关。肿瘤微环境由癌细胞、免疫细胞、基质细胞及其他成分组成。已有研究表明，癌相关成纤维细胞（CAF）、单核细胞/巨噬细胞等TME组分与癌症的治疗反应和预后密切相关。然而，传统的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术仅能揭示细胞的基因表达特征，缺乏空间信息。本研究通过整合单细胞转录组学和空间转录组学技术，探讨了NSCLC中肿瘤边界及TME的细胞组成与功能状态变化，以及这些变化与ICB-化疗疗效之间的关系。

1. 研究对象与分组：

• 样本来源：19例NSCLC患者的26份肿瘤样本，包括化疗和ICB联合治疗前后样本。

• 匹配样本：7名患者提供了治疗前后配对的肿瘤组织样本。

2. 实验技术与数据处理

1）单细胞转录组学（scRNA-seq）：

• 测序平台：10x Genomics。

• 质量控制：去除低质量细胞和双重细胞后，分析232,080个单细胞。

• 细胞分型：基于UMAP降维聚类和细胞特异性标志基因进行注释。

2）空间转录组学：

• 平台：NanoString GeoMx DSP与10x Genomics Visium。

• 分析内容：肿瘤核心、边界及基质区域中细胞的空间分布和相互作用。

3. 统计分析：

• 基因集富集分析（GSEA）：分析细胞状态的功能模块。

• 细胞互作分析：通过NicheNet和CellChat预测细胞间配体-受体互作。

• 生存分析：使用Cox比例风险模型和Kaplan-Meier生存曲线评估特定细胞类型与患者预后的相关性。

1）总体细胞分布：

• 在232,080个单细胞中，通过UMAP聚类发现主要细胞类型包括上皮细胞（64,947个，占28.0%）、免疫细胞（T细胞、B细胞、单核细胞/巨噬细胞等，共占41.2%）和基质细胞。

• 上皮细胞进一步分为正常和恶性细胞，非应答者治疗后恶性细胞比例基本未变化，而应答者中恶性细胞几乎完全消失。

2）免疫细胞的治疗前后变化：

• 单核细胞/巨噬细胞的比例在非应答者中由治疗前的30.2%显著升至治疗后的45.1%（P = 0.029）。

• 树突状细胞（DC）比例在非应答者中也显著增加（由4.5%增加至7.6%，P = 0.015）。

3）基质细胞的治疗前后变化：

• COL11A1+癌相关成纤维细胞（CAFs）在非应答者中占基质细胞的比例显著升高，由治疗前的26.3%增加至39.4%（P = 0.029）。

• ADH1B+ CAFs在治疗后无显著变化，占比保持在20%左右。

2：癌细胞状态的异质性与治疗响应

1）癌细胞状态分类：

• 癌细胞分为14种状态，包括NRF2目标基因状态、干扰素（IFN）状态、细胞周期状态等。状态分类基于UMAP聚类和基因富集分析。

• NRF2目标基因相关状态在非应答者的治疗前样本中显著升高（P = 0.047），而干扰素γ（IFNγ）状态在应答者中显著增强（P = 0.029）。

2）治疗前后的状态变化：

• NRF2目标基因状态分值在非应答者的治疗前样本中高于应答者（0.45 vs 0.31），在治疗后无显著下降（0.47 vs 0.32，P > 0.05）。

• 干扰素状态分值在应答者的治疗后显著增加（0.42 vs 0.28，P = 0.029）。

3）功能相关性：

• 高NRF2目标基因状态与较差的总体生存率相关（HR = 2.35，95% CI: 1.34–3.68，P < 0.01）。

• 高干扰素状态的患者总体生存率显著提高（HR = 0.61，95% CI: 0.45–0.82，P < 0.01）。

3：肿瘤微环境的空间结构

1）细胞类型空间分布：

• 通过空间转录组学定义15种细胞背景，其中COL11A1+ CAFs显著富集于肿瘤边界，占肿瘤侵袭区域细胞的比例超过40%。

• 恶性细胞主要集中于肿瘤核心区域，占肿瘤核心细胞的比例为85%，而在基质区域中几乎检测不到（<5%）。

2）细胞互作网络：

• 肿瘤边界的COL11A1+ CAFs通过物理屏障和生化作用与免疫细胞形成局部互作环境。

• 高密度的胶原沉积在COL11A1+ CAFs富集区域形成。

4：COL11A1+ CAFs的促肿瘤作用

1）基因功能分析：

• COL11A1+ CAFs高度表达低氧响应基因（如HIF1A, P = 0.002），胶原相关基因（如COL1A1和COL11A1, P < 0.001），以及TGF-β信号相关基因（如TGFB1, P < 0.01）。

• COL11A1+ CAFs在非应答者治疗前的比例显著高于应答者（45.3% vs 28.7%，P = 0.0037）。

2）预后相关性：

• Cox模型分析显示，COL11A1+ CAFs高表达的患者5年生存率低于25%，而低表达患者的生存率接近60%（HR = 2.87, 95% CI: 1.58–5.25, P < 0.001）。

5：SPP1+巨噬细胞与COL11A1+ CAFs的协同作用

1）空间分布：

• SPP1+巨噬细胞显著分布于肿瘤边界区域，占肿瘤边界免疫细胞的比例达45%，在基质区域比例低于10%。

• SPP1+巨噬细胞的治疗后比例在非应答者中显著增加（18.5% vs 11.4%，P = 0.006）。

2）细胞互作分析：

• 通过CellChat分析发现，SPP1+巨噬细胞通过SPP1–CD44配体-受体对与COL11A1+ CAFs发生互作，促进胶原沉积（P < 0.01）。

• 在肿瘤边界中，高SPP1+巨噬细胞和高COL11A1+ CAFs共存区域的T细胞浸润显著减少（2.5% vs 8.7%，P = 0.003）。

3）预后影响：

• 同时高表达SPP1+巨噬细胞和COL11A1+ CAFs的患者生存率显著降低（HR = 12.41, 95% CI: 1.13–136.7, P = 0.049）。

6：TLSs的分布与成熟状态

1）TLS的分类：

• 根据基因表达模式和空间分布，将TLSs分为早期聚集、活化、衰退和晚期状态。

• 应答者中活化TLS占比显著高于非应答者（67% vs 24%，P = 0.002）。

2）低氧影响：

• 非应答者的晚期TLS中高表达低氧响应基因HIF1A（P < 0.01），提示低氧可能导致TLS功能受抑。

3）肿瘤负荷相关性：

• 活化TLS与较低的残余肿瘤负荷显著相关（22% vs 43%，P = 0.003）。

7：TLSs的临床意义

1）治疗应答预测：

• 在另一独立NSCLC队列中，活化TLS特征分值在应答者中显著高于非应答者（P = 0.002）。

• 活化TLS高分组患者的总体生存率显著提高（HR = 0.45, 95% CI: 0.29–0.62, P < 0.001）。

2）生存率分析：

• Cox比例风险模型显示，活化TLS特征高分值患者的5年生存率超过60%，显著高于低分值组的20%（P < 0.0001）。

• 本研究通过整合单细胞RNA测序和空间转录组学技术，对非小细胞肺癌（NSCLC）患者免疫检查点抑制剂（ICB）联合化疗前后的肿瘤微环境（TME）进行深入分析，揭示了与治疗耐药性及应答相关的关键细胞和分子机制。

• 癌相关成纤维细胞（CAFs）：COL11A1+ CAFs显著富集于肿瘤边界，并通过与肿瘤细胞的DDR1–COL11A1相互作用促进胶原沉积，阻碍T细胞浸润。其高表达与治疗耐药性及较差的患者预后相关。。

• 巨噬细胞的作用：SPP1+巨噬细胞通过与COL11A1+ CAFs的SPP1–CD44互作，进一步增强了肿瘤边界的免疫抑制屏障，并与患者生存率降低相关。

• 次级淋巴结构（TLSs）：活化TLS与较好的治疗应答和较低的残余肿瘤负荷显著相关，而低氧状态的TLS在非应答者中表现出功能衰退。

• 治疗响应的关键标志物：COL11A1+ CAFs的比例可作为ICB-化疗耐药性的负向预测标志物。活化TLS特征基因表达是ICB-化疗应答性和患者总体生存率的正向预测标志物。