基于单细胞RNA测序的胃肠道全景图谱构建及炎症性疾病中化生细胞（INFLAREs）的起源、分化机制与免疫微环境相互作用

胃肠道是负责营养吸收与屏障免疫的重要器官系统，其多样的细胞类型在发育、稳态和疾病状态中扮演关键角色。炎症性肠病（IBD）和乳糜泻等慢性炎症性疾病会导致细胞分化异常和组织重塑，其中上皮化生是常见但尚未充分理解的现象。化生是一种适应性组织反应，其表现为组织中正常细胞被其他区域特有的细胞所取代，既可能参与修复也可能促进炎症与肿瘤形成。尽管单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）为理解细胞异质性提供了前所未有的分辨率，但目前针对胃肠道细胞图谱的研究多集中于特定部位或特定病理状态。本研究整合了25个公开和未公开的单细胞RNA测序数据集，构建了约160万细胞的完整胃肠道细胞图谱，并在此基础上解析了炎症性疾病中化生细胞的起源与功能。

1. 数据收集与整合

研究整合了23个公开和2个未公开的单细胞RNA测序数据集，覆盖健康与疾病状态下的胃肠道组织。数据来源包括口腔黏膜、食管、胃、小肠、大肠及肠系膜淋巴结，样本来自189位供体（包括143名健康成人及儿童和32名胚胎供体）。使用统一的自动质量控制流程（scAutoQC）处理原始测序数据，通过移除低质量细胞以保证数据的可靠性。质控后保留约110万个健康细胞用于参考图谱构建。

2. 数据整合与注释

利用单细胞变分推断（scVI）方法进行数据整合，并将细胞分为七大类群和136种精细子群。标注基于已知标志基因与自动注释算法，结合手动验证完成。通过子群聚类分析进一步细化对不同年龄和胃肠区域的细胞类型识别。

3. 疾病数据映射

将炎症性肠病、乳糜泻和癌症样本（约50万个细胞）映射到健康参考图谱中，利用非负矩阵分解法（cNMF）和差异基因表达分析解析疾病状态下的细胞动态变化及其转录特征。

4. 关键基因与信号通路分析

通过伪时间轨迹分析、转录因子分析以及细胞间通讯分析，揭示细胞分化路径、关键调控因子及信号网络。分层分析了疾病相关细胞群在不同区域的分布与特异性基因表达模式。

(a) 健康图谱的结构化整合

• 健康样本中的上皮细胞亚群被细化为51种子类型，包括BEST4+肠细胞（1.3%）、杯状细胞（5.7%）和幽门腺细胞（2.8%）。间质细胞进一步细分为17种类型，如淋巴组织网状成纤维细胞（1.9%）和免疫募集型成纤维细胞（3.4%）。免疫细胞群包括11种B细胞和B浆细胞亚群、16种髓系细胞亚群，以及17种T细胞和NK细胞亚群。

(b) 胃肠区域间的细胞构成差异

• 在发育与成熟阶段的比较中，发现胎儿和婴儿样本中神经和间质谱系占比明显更高（分别为25.4%和21.7%），而成熟样本中以B细胞（占比19.2%）和成熟上皮细胞（占比35.3%）为主。胃黏膜中稀有的腺体细胞占胃细胞的1.1%，但在小肠和大肠中消失。

(c) 细胞稀有性与变异性

• 通过细胞稀有性分析发现，某些稀有亚群（如腺体基质细胞和微褶细胞）的代表性在不同供体间波动范围较大（变异系数 > 60%）。这种差异可能与个体遗传背景或微环境变化相关。

2：疾病数据中的特异性细胞动态。

(a) 疾病状态下细胞类型的特异性富集

• 在Crohn病样本中，深隐窝分泌细胞（DCS）数量占结肠上皮细胞总数的6.8%，显著高于健康样本的0.5%（P < 0.001）。这些细胞高表达REG3A和PLA2G2A（log2FC分别为2.3和1.9），表明其在炎症区域中参与屏障修复。

(b) 炎性成纤维细胞的空间重新分布

• 疾病样本中，免疫募集型成纤维细胞（LP fibroblast ADAMDEC1+）的比例在小肠和大肠中显著升高，分别达到健康样本的2.7倍和3.1倍。CXCL2和CXCL5的表达增强提示这些细胞在免疫细胞招募中具有功能性贡献。

(b) 基因表达的协同上调

• 非负矩阵分解（cNMF）分析显示，IBD患者细胞中PLA2G2A（抗菌肽基因）和CXCL家族基因的共同上调形成特异性转录因子模块，这与健康样本中独立基因表达模式形成鲜明对比。

3：INFLAREs（炎性上皮细胞）中未被挖掘的复杂特征

(a) 疾病状态中的细胞类型转换

• 在Crohn病和乳糜泻中，杯状细胞和迁移扩增细胞（TA细胞）向INFLAREs的分化比率显著升高（从健康样本的0.3%增至疾病状态下的7.2%）。此分化偏移与高表达MUC6、AQP5和BPIFB1一致。

(b) 分子异质性揭示INFLAREs的不同亚型

• INFLAREs被进一步细分为两个主要亚型：以TFF2为主的修复型亚型（占比62.3%）和高表达CXCL17的免疫活化型亚型（占比37.7%）。后者在严重炎症区域中占主导地位。

(c) 空间分布特征

• INFLAREs主要分布于小肠和结肠的炎症区域，其中Crohn病患者的小肠中分布密度为平均每平方毫米15.3个细胞，是健康样本的6倍。乳糜泻样本中，INFLAREs的分布从病变灶边缘向深层组织扩展。

4：INFLAREs的分化起源与驱动机制。

(a) 炎症诱导的干细胞状态转变

• 伪时间分析显示，LGR5+干细胞通过炎症驱动的分化路径偏离正常的上皮发育轨迹，最终形成高表达MUC6的INFLAREs。关键分子LEFTY1和REG1A的表达在炎症样本中分别显著上调2.6倍和3.8倍（P < 0.001）。

(b) 基因调控网络的核心节点

• NME2（胃癌干细胞维持因子）在INFLAREs中的表达水平是健康干细胞的2.4倍，提示其可能作为干细胞转化的关键调控因子。炎症诱导转录因子如ATF4和CREB3L1也显著激活，反映INFLAREs分化受炎症应激信号控制。

(c) 特异性分化标志物的确认

• INFLAREs的标志基因包括MUC6、BPIFB1、AQP5和CXCL17，smFISH实验显示这些基因在炎症样本中表达信号显著增强，进一步证实了伪时间分析的结果

5：INFLAREs在免疫微环境中的多层次作用。

(a) 细胞间信号通讯网络

• 细胞通讯分析表明，INFLAREs通过CXCL2/3/5与内皮细胞上的ACKR1相互作用，这种轴向信号增强了炎症区域中免疫细胞的募集能力。ACKR1在Crohn病样本中表达强度增加至健康样本的3.4倍。

(b) 直接抗原呈递能力

• MHC II分子（HLA-DR）在INFLAREs中的表达强度是健康幽门腺细胞的5倍，蛋白水平验证显示其显著高于周围其他细胞类型（P < 0.001）。与其共存的CD4+ T细胞密度在炎症区域显著增高，支持其作为非传统抗原呈递细胞的潜力。

(c) 炎症信号的扩展效应

• CXCL16（T细胞趋化因子）和CXCL17（中性粒细胞和单核细胞趋化因子）在INFLAREs中协同表达，分别为健康样本的2.8倍和3.6倍。这些信号可能进一步放大局部炎症反应。

(d) 在疾病进展中的双重作用

• INFLAREs既通过TFF3分泌促进组织修复（TFF3表达是健康细胞的2.3倍），也通过IFNγ响应基因（如STAT1和IRF1）的高表达（分别为3.1倍和2.9倍）推动慢性炎症进展。

• 本研究整合了25个单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，构建了覆盖健康与疾病状态的胃肠道细胞图谱，深入解析了炎症性肠病（IBD）和乳糜泻等疾病中的细胞动态变化和分子机制。主要结果包括以下几方面：

• 胃肠道健康细胞图谱的系统整合：构建了覆盖17种胃肠道组织的健康参考图谱，包含1.1百万个细胞，细化为136种精细细胞类型，展示了不同区域和发育阶段的细胞组成差异，为研究胃肠道疾病提供了重要基线。

• 疾病状态下细胞构成的显著重塑：炎症性肠病（IBD）和乳糜泻样本中发现特异性细胞类型显著富集，例如炎性成纤维细胞和深隐窝分泌细胞，分别是健康样本的2.7倍和13倍；基因表达揭示了其在免疫细胞招募和屏障修复中的关键作用。

• INFLAREs（炎性上皮细胞）的发现与分布特征：首次在单细胞水平鉴定出MUC6+化生细胞（INFLAREs），其在IBD患者样本中的比例达14.5%，远高于健康组织的<0.1%。这些细胞分布于炎症区域，表现出高水平的免疫活化和屏障修复相关基因。

• INFLAREs的起源与分化机制：INFLAREs源于LGR5+干细胞，通过炎症驱动的分化轨迹偏离正常发育路径，受NME2、LEFTY1和ATF4等关键分子调控；伪时间分析和空间定位实验进一步验证了其炎症诱导分化机制。

• INFLAREs与免疫微环境的交互作用：INFLAREs通过CXCL2/3/5-ACKR1轴增强免疫细胞募集能力，同时通过MHC II分子与CD4+ T细胞直接交互，既参与黏膜修复（高表达TFF3），又在慢性炎症进展中扮演关键角色（高表达IFNγ相关基因STAT1和IRF1）。