单细胞空间转录组揭示血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤的免疫抑制微环境及潜在治疗靶点

血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤（AITL）是一种侵袭性T细胞淋巴瘤，病理来源于滤泡辅助性T细胞（Tfh），在非霍奇金淋巴瘤中占比1-2%，但预后极差，复发/难治性患者（RR-AITL）的中位生存时间仅为6个月。AITL患者的肿瘤微环境（TME）高度复杂，包含大量非恶性细胞（如CD4+/CD8+ T细胞、B细胞、髓样细胞等），这些细胞的相互作用与肿瘤的进展和免疫逃逸密切相关。尽管以往研究利用传统技术，如bulk RNA-seq和微阵列，初步揭示了AITL病理过程中免疫抑制相关的信号通路，但这些方法无法解析TME的细胞异质性和空间组织。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）和成像质谱细胞学（IMC）等高分辨率技术的兴起，为探究AITL微环境中的细胞成分、分子机制及空间结构提供了全新契机。本研究利用这些技术，系统分析了新诊断（ND-AITL）和复发/难治性AITL患者的TME特征，旨在识别RR-AITL特有的免疫逃逸机制和潜在治疗靶点。

1. 样本采集与处理：

• 从正常对照（NC）、ND-AITL和RR-AITL患者的淋巴组织中提取单细胞，用于单细胞RNA测序和IMC分析。

• 通过质量控制获得55,482个高质量转录组数据（24,581个来自NC，17,610个来自ND-AITL，13,291个来自RR-AITL），并使用IMC技术获取203,520个细胞的空间数据。

2. 单细胞RNA测序分析：

• 对数据进行无监督聚类，基于已知基因标记鉴定主要细胞类型（如T/NK细胞、B细胞、髓样细胞和基质细胞）。

• 应用SingleR方法验证细胞注释的准确性，计算高表达基因的相关性以确认细胞分类的鲁棒性。

• 使用转录因子活性分析（pySCENIC）推测潜在的调控网络，并结合主成分分析（PCA）探索细胞间转录调控模式。

3. 成像质谱细胞学（IMC）分析：

• 构建针对AITL的35种抗体标记面板，包括细胞类型、免疫状态和细胞状态标记。

• 对每个感兴趣区域（ROI）进行单细胞分割，利用多维尺度分析（MDS）比较ND-AITL和RR-AITL的空间异质性。

4. 验证实验：

• 通过免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）对关键标志物（如YY1、CXCL13、PD-L1）的表达进行验证。

• 结合基因集合富集分析（GSEA）和假时间分析，探索细胞发育轨迹和功能状态的变化。
  

• 细胞分布差异：ND-AITL和RR-AITL样本中，T/NK细胞是主要成分（分别占约73.5%和72%），其次是B细胞（分别占22.1%和23.3%），髓样细胞和基质细胞在两组中比例较低，但RR-AITL中髓样细胞的比例略高，显示其潜在的功能变化。

• 空间异质性：UMAP和IMC数据显示，RR-AITL的细胞空间分布具有更高的异质性。MDS分析中，RR-AITL的ROI与ND-AITL呈明显分离，表明肿瘤微环境的结构性变化。

• 标记物表达：通过IMC显示，T细胞标志物CD3和Tfh标志物CXCL13在ND-AITL中表达较高，而RR-AITL中CXCL13的表达明显减弱，与肿瘤细胞表型丧失一致。

2: 恶性Tfh细胞的增殖增强

• 细胞亚群的特化：通过UMAP将T/NK细胞分为10个亚群，T_C2和T_C4被注释为恶性Tfh细胞。这些亚群在ND-AITL和RR-AITL中的比例差异显著，T_C2和T_C4在RR-AITL中明显富集。

• CXCL13的下降：恶性Tfh细胞中CXCL13的表达显著下降，且AITL特征基因的富集得分也在RR-AITL中显著降低（P < 2.2e-16），提示恶性细胞可能丧失了部分功能性标志。

• 转录因子活性差异：恶性Tfh细胞的转录因子活性中，SOX4显著上调，与增殖和干性相关的信号通路显著富集，包括E2F靶点（NES=2.03, P < 2.2e-16）和G2M检查点（NES=1.56, P = 0.0018）。

• PI3K/AKT信号激活：恶性Tfh细胞的PI3K/AKT信号通路活性增强，pAKT蛋白在IMC数据中呈显著高表达。

• 活性与表达模式：YY1活性和表达在RR-AITL中显著高于ND-AITL（P < 2.2e-16）。通过IMC观察，恶性Tfh细胞中YY1蛋白的染色强度显著增强。

• 靶基因功能分析：YY1靶基因显著富集于PI3K/AKT/mTOR通路、G2M检查点和Myc靶点相关的增殖信号。这些靶基因约有34%直接与PI3K/AKT/mTOR信号重叠。

• 负调控免疫功能：YY1活性与免疫相关通路（如TNF-α信号和IL6/JAK/STAT3信号）呈负相关（ρ = -0.307, P < 2.2e-16），表明其可能通过抑制炎症信号促进肿瘤免疫逃逸。

• 预后相关性：高YY1表达患者的生存期显著缩短（P = 0.009），提示YY1是RR-AITL中一个重要的预后标志物。

4. CD8+ T细胞的减少与功能耗竭

• 亚群比例变化：RR-AITL中CD8+ T细胞比例显著降低（P = 2.0e-11），Tregs比例显著升高（P = 1.487e-13）。CD4+ Tem细胞在RR-AITL中的比例也略有下降。

• 细胞毒性减少：CD8+ T细胞的细胞毒性评分在RR-AITL中显著降低（P = 9.0e-06），而耗竭评分显著升高（P = 2.4e-03），耗竭标志物PD-1、TIGIT和CTLA4的表达增强。

• PD-L1表达增强：恶性Tfh细胞的PD-L1表达在RR-AITL中显著增加（P < 2.2e-16），抑制了CD8+ T细胞的效应功能。

• 与YY1的相关性：YY1活性与CD8+ T细胞比例呈负相关（ρ = -0.57, P < 0.01），进一步表明YY1可能参与了免疫抑制的形成。

5: B细胞的恶性转化

• 差异基因表达：RR-AITL中的B细胞具有更高的RGS13表达（P < 0.001），而ND-AITL中的B细胞则更倾向于高表达浆细胞标志物（如IGHG2和MZB1）。

• 中间转化状态：假时间分析显示，B细胞在RR-AITL中位于ND-AITL和DLBCL之间，表现为代谢活性显著强，尤其是甘油磷脂代谢和肌醇磷酸代谢。

• 肿瘤相关基因表达增强：MYC、PCNA和CD24的表达随着B细胞从ND-AITL向RR-AITL再到DLBCL的进展而逐步升高，表明其具有恶性转化潜能。

6: 髓样细胞功能障碍

• 比例与功能：RR-AITL中髓样细胞比例显著升高（P = 0.04），但其吞噬和抗原呈递能力显著下降（P < 0.001）。APOE+巨噬细胞的脂肪酸代谢活性下降，提示其功能性受损。

• 免疫逃逸机制：B细胞和恶性Tfh细胞通过高表达CD47阻碍髓样细胞的吞噬功能。RR-AITL中髓样细胞主导的空间结构占比（CN4和CN6）显著高于ND-AITL。

7: 配体-受体相互作用网络

• 特有交互：RR-AITL中特有的CLEC2D-KLRB1、CTLA4-CD86和MIF-CD74相互作用网络显著增强，可能通过抑制效应T细胞功能增强免疫逃逸。

• 空间共定位：髓样细胞与恶性Tfh细胞、B细胞的空间共定位在RR-AITL中更为紧密，进一步说明髓样细胞在支持肿瘤免疫逃逸中的关键作用。

• RR-AITL的肿瘤微环境（TME）展现出显著的异质性和免疫抑制特征。髓样细胞主导的空间结构比例显著增加，而T细胞主导的结构减少，提示免疫功能受到显著削弱。恶性Tfh细胞在RR-AITL中显著富集，增殖能力增强，PI3K/AKT信号通路活性显著提升，并伴随CXCL13和AITL特征基因表达的下降，显示其功能表型部分丧失。关键转录因子YY1在RR-AITL中活性显著上调，通过驱动增殖相关通路（如G2M检查点和E2F靶点）的激活，同时抑制免疫相关通路（如TNF-α信号），在增殖和免疫逃逸中起核心作用。此外，RR-AITL中CD8+ T细胞的比例显著下降，耗竭状态增强，表现为PD-1、TIGIT和CTLA4的高表达；而B细胞呈现向恶性转化的中间状态，MYC和PCNA等肿瘤相关基因逐步上调，代谢活性增强。髓样细胞尽管比例增加，但吞噬和抗原呈递功能显著下降，与B细胞和恶性Tfh细胞高表达的“别吃我”信号（CD47）相关。RR-AITL中特有的免疫抑制配体-受体相互作用网络（如CLEC2D-KLRB1和MIF-CD74）进一步促进了免疫逃逸。这些结果共同揭示了RR-AITL中肿瘤微环境的复杂免疫抑制机制及潜在治疗靶点。