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医学科研新动向
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Efficacy of CTLA-4 checkpoint therapy is dependent on IL-21 signaling to mediate cytotoxic reprogramming of PD-1+CD8+ T cells
Nature Immunology
<2024/12/19>
研
究
背
景
免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Blockade, ICB）通过解除免疫抑制，增强T细胞的抗肿瘤功能，已成为治疗晚期黑色素瘤等多种恶性肿瘤的重要手段。然而，不同检查点靶向疗法的临床疗效存在显著差异。例如，抗PD-1单一疗法在诱导持久免疫反应方面优于抗CTLA-4单一疗法，但联合这两种疗法（dual-ICB）能显著提高总生存率和持久反应率，提示联合疗法的免疫学机制具有独特之处。既往研究表明，PD-1单一疗法主要通过激活前体耗竭性T细胞（TPex），恢复其抗肿瘤效应，而抗CTLA-4疗法则可能通过促进T细胞初始激活和抗原特异性扩增起作用。然而，这些机制在联合疗法中如何协同作用以实现更高的疗效仍未被充分揭示，特别是对PD-1+CD8+ T细胞（TResp）的重编程及相关信号通路的研究尚不完善。基于此，本研究通过对接受dual-ICB疗法患者的免疫表型、转录组和T细胞受体谱的综合分析，揭示了IL-21信号在调控TResp细胞功能中的关键作用，并进一步验证了IL-21信号对抗CTLA-4疗效的必要性，从而为理解联合疗法的免疫学机制提供了新的见解。
研究设计
1. 患者样本与分组
招募晚期或转移性黑色素瘤患者，分为接受抗PD-1单一疗法、抗CTLA-4单一疗法或dual-ICB疗法的组别。
通过流式细胞术和质谱流式（CyTOF）检测治疗前后CD8+ T细胞的表型变化。
2. 单细胞RNA测序（scRNA-seq）与T细胞受体谱分析
分离患者外周血中的PD-1+CD8+ T细胞进行单细胞转录组测序，探讨治疗前后基因表达的动态变化。
通过TCR谱分析追踪扩增的T细胞克隆，并结合转录组分析探索克隆扩增与功能变化的关系。
3. 调控网络分析
使用SCENIC工具推断T细胞转录因子活性网络，比较不同治疗组别下T细胞的调控特性。
4. 功能实验与小鼠模型验证
在体外通过IL-21或其他细胞因子刺激扩增抗原特异性CD8+ T细胞，评估IL-21对细胞毒性和耗竭标志物表达的影响。
利用IL-21受体敲除小鼠（Il21r−/−）建立黑色素瘤模型，验证IL-21信号对抗CTLA-4疗法效应的必要性。
5. 数据分析与统计
使用配对统计检验、克隆动态分析、基因集富集分析（GSEA）等方法对实验数据进行严谨分析。
核心结果
Ki-67表达与增殖：PD-1+CD8+ T细胞中Ki-67表达在dual-ICB组治疗后显著增加，显示出显著的细胞增殖活性。基线和治疗后相比，dual-ICB组的Ki-67阳性细胞比例大幅提升，与单疗法相比具有显著差异。
颗粒酶B和穿孔素表达：Dual-ICB组的PD-1+CD8+ T细胞在治疗后显示出更高的颗粒酶B（GzmB）和穿孔素（Perforin）表达，这表明其细胞毒性功能显著增强。
细胞因子分泌：治疗后，Dual-ICB组的PD-1+CD8+ T细胞表现出较强的IFN-γ分泌能力，而TNF的表达相对减少。
耗竭前体细胞减少：在dual-ICB治疗后，CD127+TCF-1+的耗竭前体T细胞显著减少，表明这些细胞经历了功能性重编程。
2: Dual-ICB显著改变PD-1+CD8+ T细胞的转录组特性和克隆动力学
UMAP分析：Dual-ICB组的PD-1+CD8+ T细胞在治疗后分布于新的转录簇，尤其是高表达GZMB、PRF1等细胞毒性基因的cluster c2显著增加，而TPex相关基因（如TCF7, BCL2）高表达的cluster c3明显减少。
克隆扩增：通过TCR谱分析发现，dual-ICB治疗后扩增的克隆主要富集于cluster c2，而与非肿瘤抗原相关的克隆未表现出类似的扩增趋势。
抗原特异性验证：扩增克隆中富含黑色素瘤抗原特异性TCR（如MART-1特异性），这在dual-ICB组中得到了四聚体染色的验证。
SCENIC分析：通过推断转录调控网络发现，dual-ICB组中STAT1和STAT3调控网络显著活跃，特别是在regulon_c3中，该簇在dual-ICB后显著扩增。
STAT调控模式差异：与单疗法的STAT5活性偏高不同，dual-ICB特异性诱导了AP-1转录因子家族（如JUN, FOS）的显著活跃，且表现出更高的PRDM1和STAT3活性。
耗竭与细胞毒性平衡：dual-ICB组的PD-1+CD8+ T细胞同时具有耗竭相关标志物（如TOX）的高表达以及细胞毒性基因（如GZMB, PRF1）的显著激活，体现了独特的功能性重编程。
4: IL-21信号在Dual-ICB中的关键作用
IL-21受体表达：Dual-ICB特异性诱导了PD-1+CD8+ T细胞中的IL-21受体（IL21R）表达，与IL-21相关的STAT1和STAT3磷酸化水平显著提升。
体外实验：在体外，IL-21刺激抗原特异性CD8+ T细胞显著增强了颗粒酶B和穿孔素的表达，同时降低了CD38的表达，显示出细胞毒性功能的提升和部分耗竭特性的缓解。
5: CTLA-4单疗法激活IL-21相关信号
CITE-seq分析：CTLA-4单疗法（ipilimumab）治疗后，患者的CD8+ T细胞中特定簇（如cluster 3）扩增显著，其中IL21R、GZMB和PRF1的表达显著上调。
IL-21基因集富集：Pathway富集分析表明，IL-21信号在CTLA-4单疗法中被显著激活，其基因集表达在治疗后与dual-ICB具有一致性。
6: IL-21信号是CTLA-4疗效的关键
小鼠模型验证：在Il21r−/−小鼠中，抗CTLA-4治疗未能显著延长生存时间，而在野生型（WT）小鼠中，抗CTLA-4治疗显著改善生存，表明IL-21信号对疗效的决定性作用。
生存分析：小鼠生存曲线显示，IL-21受体缺失显著削弱了抗CTLA-4治疗的疗效，而抗PD-1单疗法在此模型中的效果相对较弱。
小
结
本研究通过多层次的实验分析系统揭示了抗CTLA-4和抗PD-1联合疗法（dual-ICB）在晚期黑色素瘤治疗中独特的免疫机制，具体包括以下几个关键发现：
增强细胞毒性功能：Dual-ICB治疗显著提高PD-1+CD8+ T细胞的细胞毒性功能，包括颗粒酶B和穿孔素的表达，同时诱导增殖活性（Ki-67升高）。
功能性重编程：Dual-ICB导致前体耗竭T细胞（TPex）的减少，同时促进功能耗竭标志（LAG-3和TOX）与细胞毒性基因（GZMB、PRF1）共同表达的特性。
克隆特异性扩增：治疗后肿瘤抗原特异性克隆（如MART-1）的扩增显著，而非肿瘤相关克隆未见明显变化。
IL-21信号关键作用：Dual-ICB显著激活PD-1+CD8+ T细胞中的IL-21受体（IL21R）和下游STAT1/STAT3信号，并通过IL-21驱动细胞毒性分化。
抗CTLA-4疗效依赖IL-21信号：小鼠模型验证显示，IL-21信号缺失（Il21r−/−）削弱抗CTLA-4疗法的生存获益，表明IL-21信号对疗效至关重要。
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