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医学科研新动向
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Integrated explainable machine learning and multi-omics analysis for survival prediction in cancer with immunotherapy response
Cell Death Differ
<2024年12月07日>
研
究
背
景
非小细胞肺癌（NSCLC）中KRAS基因突变是肿瘤发生的重要驱动因素，其通过代谢重编程适应快速生长的需求，同时依赖复杂的抗氧化机制应对代谢中反应性氧物质（ROS）的积累。然而，这种代谢和抗氧化依赖也使KRAS突变细胞对ROS平衡更为敏感，从而暴露出潜在的治疗靶点。铁死亡（ferroptosis）是一种依赖铁介导的脂质过氧化导致的非凋亡性细胞死亡形式，通常被癌细胞通过多种抗氧化策略逃避，其中以SLC7A11调控的谷胱甘肽（GSH）代谢轴最为关键。乳酸脱氢酶B亚型（LDHB）传统上被认为参与乳酸代谢和线粒体功能，但其在KRAS驱动肿瘤中的非经典作用尚不明确。本研究揭示LDHB通过调控SLC7A11非经典地促进了KRAS突变肺癌细胞的抗铁死亡防御，并探讨其作为代谢合成致死性治疗靶点的可能性。
研究设计
1. 细胞系实验：
使用A549、H838等KRAS突变和野生型NSCLC细胞，通过siRNA和shRNA沉默LDHB。
利用代谢组学（LC-MS）分析LDHB敲降后代谢变化。
通过药物筛选和存活率检测（如克隆形成实验）评估细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。
2. 动物模型：
在A549和H460异种移植模型中验证LDHB和SLC7A11抑制剂（如erastin和SSZ）的作用。
在基因编辑小鼠模型（KrasG12D/WT; p53fl/fl; Ldhb−/−）中评估LDHB功能对肿瘤生长的影响。
3. 分子机制：
利用RNA测序和免疫印迹分析SLC7A11及相关基因的表达。
鉴定LDHB调控SLC7A11的机制，重点研究转录因子STAT1在其中的作用。
4. 功能验证：
通过线粒体氧耗率（OCR）和活性氧检测研究代谢途径改变。
结合化学抑制剂（如CB839，靶向谷氨酰胺代谢）进一步解析代谢合成致死性。
核心结果
通过代谢组学（LC-MS）分析，LDHB敲降组（siLDHB）和对照组（siNT）A549细胞的代谢物丰度热图显示，LDHB敲降后多种代谢物显著下调，包括谷胱甘肽（GSH）代谢相关代谢物，如半胱氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸。 通路富集分析揭示，LDHB敲降导致GSH合成和其他代谢途径显著抑制，提示GSH代谢在LDHB功能中的关键作用。
GSH代谢通路示意图展示了LDHB敲降如何影响关键基因（如GCLC、GCLM和GSR）和代谢物（如GSH、GSSG）的水平。
LDHB敲降细胞中GSH含量和GSH/GSSG比值显著降低（p<0.05），但GSSG水平无明显变化，表明LDHB对抗氧化状态的调控主要通过GSH代谢。
基因集富集分析（GSEA）显示，LDHB敲降显著下调GSH代谢相关基因的转录水平。
LDHB敲降后，A549和H838细胞的GSH/GSSG比值显著下降，进一步支持LDHB对细胞内氧化还原平衡的关键作用。
2. LDHB敲降增强KRAS突变细胞对铁死亡诱导剂的敏感性
免疫印迹实验显示，LDHB敲降有效抑制KRAS突变细胞中LDHB蛋白表达。
药物筛选结果热图显示，erastin等铁死亡诱导剂在LDHB敲降细胞中表现出更强的抑制效应。
通过药物曲线计算的AUC显示，LDHB敲降显著增强了KRAS突变细胞对erastin的敏感性（AUC显著降低，p<0.05）。
克隆形成实验表明，LDHB敲降细胞经erastin处理后存活率显著降低，表明LDHB抑制诱导铁死亡。
脂质过氧化检测显示，LDHB敲降细胞脂质过氧化水平显著升高，符合铁死亡特征。
细胞活性检测结果显示，LDHB敲降显著增强细胞对SLC7A11和GPX4抑制剂的敏感性。
SSZ（SLC7A11抑制剂）在LDHB敲降细胞中诱导的细胞死亡和脂质过氧化显著增强，但可被铁死亡抑制剂LIP1完全逆转，进一步证实铁死亡机制。
3. LDHB抑制通过SLC7A11下调导致铁死亡敏感性
免疫印迹结果显示，LDHB敲降后，A549、H838和小鼠KP细胞中LDHB蛋白显著降低。
克隆形成实验显示，LDHB敲降联合铁死亡诱导剂erastin处理显著降低细胞存活率。
铁死亡标志物PTGS2的qPCR结果显示，LDHB敲降联合RSL3或erastin处理显著增加PTGS2表达。
细胞活性分析显示，LDHB敲降细胞对铁死亡诱导剂的敏感性显著增强，但这种效应可被铁死亡抑制剂FER1完全逆转。
流式细胞仪分析脂质过氧化水平，LDHB敲降细胞经RSL3或erastin处理后脂质过氧化显著增加，FER1可显著减轻这一效应。
克隆形成实验中，抗氧化剂NAC能够显著缓解LDHB敲降细胞在铁死亡诱导剂处理下的存活率下降，表明氧化应激是导致铁死亡的核心因素。
4. LDHB通过STAT1调控SLC7A11表达
RNA测序显示，LDHB敲降导致SLC7A11的mRNA表达显著下降。
免疫印迹实验进一步证实，LDHB敲降下SLC7A11蛋白水平显著降低。
在LDHB敲降细胞中过表达SLC7A11可显著恢复对erastin的耐受性。
脂质过氧化检测显示，SLC7A11过表达显著降低LDHB敲降细胞中脂质过氧化水平。
LDHB敲降显著上调STAT1蛋白表达，而STAT1上调可通过抑制SLC7A11表达诱导铁死亡。
ChIP实验显示，LDHB敲降增强STAT1对SLC7A11启动子GAS2区域的结合，进一步验证其直接转录调控作用。
STAT1敲除实验表明，其表达对LDHB敲降细胞的铁死亡敏感性具有决定性作用。
5. LDHB/SLC7A11抑制通过激活谷氨酰胺代谢诱导铁死亡
代谢组学结果显示，LDHB敲降联合erastin处理显著激活谷氨酰胺代谢，而GSH代谢显著受抑。
谷氨酰胺代谢相关代谢物（如谷氨酸、γ-谷氨酰肽）水平显著升高，表明谷氨酰胺代谢增强。
OCR分析显示，LDHB敲降细胞经erastin处理后线粒体氧化磷酸化水平显著升高。
谷氨酰胺代谢抑制剂CB839能够显著降低LDHB敲降细胞中的氧耗率和线粒体ROS水平。
细胞存活分析显示，谷氨酰胺代谢抑制剂显著缓解LDHB敲降细胞在铁死亡诱导剂处理下的细胞死亡。
6. LDHB/SLC7A11联合抑制在体内显著抑制KRAS驱动肿瘤在A549和H460异种移植小鼠模型中，LDHB敲降联合erastin或SSZ显著抑制肿瘤生长。
显微CT成像和H&E染色显示，小鼠肺组织中肿瘤负担显著减少。
LDHB敲降小鼠模型中，肿瘤体积、数量和平均肿瘤尺寸显著降低（p<0.01）。
LDHB敲除联合SSZ显著延长小鼠生存期。
在A549和H460异种移植小鼠模型中，LDHB敲降联合erastin或SSZ显著抑制肿瘤生长。
显微CT成像和H&E染色显示，小鼠肺组织中肿瘤负担显著减少。
LDHB敲降小鼠模型中，肿瘤体积、数量和平均肿瘤尺寸显著降低（p<0.01）。
LDHB敲除联合SSZ显著延长小鼠生存期。
7. LDHB/SLC7A11调控铁死亡的机制模型
LDHB在KRAS驱动的非小细胞肺癌（NSCLC）中的非经典功能，揭示了其通过调控SLC7A11和GSH代谢轴在细胞抗铁死亡机制中的关键作用。LDHB通过维持GSH水平抑制脂质过氧化，保护KRAS突变细胞免受铁死亡。此外，LDHB抑制显著削弱GSH依赖的抗氧化防御，诱导谷氨酰胺代谢的过度活化，进而通过线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）产生过量的线粒体活性氧（mitoROS），最终导致铁死亡。细节路径如下：
LDHB通过维持GSH代谢抑制脂质过氧化，保护KRAS突变NSCLC细胞免受铁死亡。
LDHB敲降削弱了GSH依赖的抗氧化防御，显著下调SLC7A11的表达。
LDHB/SLC7A11抑制诱导代谢重编程，增强谷氨酰胺代谢和OXPHOS，导致线粒体ROS积累。
线粒体ROS的过量积累引发脂质过氧化，最终通过铁死亡途径导致细胞死亡。
小
结
本文首次揭示了LDHB在KRAS驱动的非小细胞肺癌（NSCLC）中的非经典作用，即通过调控SLC7A11和GSH代谢轴帮助细胞抵御铁死亡。研究结果表明，LDHB不仅在代谢层面支持细胞的抗氧化防御，还通过STAT1介导的转录调控机制下调SLC7A11的表达，进一步削弱铁死亡敏感性。此外，LDHB敲降诱导细胞发生代谢重编程，包括增强谷氨酰胺代谢和线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），导致线粒体活性氧（mitoROS）水平升高，脂质过氧化增加，最终通过铁死亡途径触发细胞死亡。
通过体外和体内实验，研究全面评估了LDHB敲降联合SLC7A11抑制的代谢合成致死效应，并验证其对KRAS突变NSCLC的治疗潜力。在异种移植和小鼠模型中，LDHB/SLC7A11双重抑制显著抑制了肿瘤生长，减少肿瘤负担，并延长生存期，进一步支持其作为治疗靶点的潜在价值。
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