机器学习免疫肽谱学：SARS-CoV-2 T细胞表位解析及下一代疫苗开发的新型框架

1. 问题：

• 新冠疫情当前疫苗以刺突蛋白（Spike Protein, S蛋白）为核心，激发中和抗体和T细胞免疫。然而，S蛋白的高突变率导致部分变异株具备免疫逃逸能力，严重削弱疫苗的保护效力。

2. 研究需求：

• T细胞靶向疫苗的重要性： 相比抗体，T细胞可识别保守性抗原表位，为突破性变异株提供长期保护。

• 表位筛选技术的瓶颈： 现有基于质谱（MS）的免疫肽谱学方法存在识别灵敏度和准确性不足的问题，且难以覆盖非规范表位（例如移码肽段）。

3. 研究目标：

• 本研究通过开发机器学习增强的免疫肽谱学工具“MHCvalidator”，提升表位鉴定的灵敏度与准确性，并结合基因组数据和疫苗免疫学分析，优化SARS-CoV-2的T细胞疫苗设计。

研究构建了一个六模块的分析框架，具体方法如下：

1. 免疫肽谱数据采集：

• 使用质谱技术（LC-MS/MS）分析HLA I类肽段。

• 数据来自SARS-CoV-2感染细胞和100,512名感染者的体内RNA测序。

2. MHCvalidator工具开发：

• 集成多层感知机（MLP）、NetMHCpan和MHCflurry算法，用于预测抗原加工和HLA结合亲和力。

• 设置1%假发现率（FDR）评估PSM置信度。

3. 低输入样本灵敏度测试：

• 用两倍稀释样本序列数据（从未稀释到16倍稀释），验证MHCvalidator的灵敏度和特异性。

4. 非规范表位鉴定：

• 对免疫肽谱数据中的移码肽段进行深入分析。

• 使用100,512例体内RNA数据检测表位发生频率，分析其生成机制。

5. 表位免疫原性评估：

• 使用ELISpot实验，测试HLA匹配个体中表位诱导CD8+ T细胞的能力，分析免疫反应频率。

6. 疫苗相关表位的突变动态追踪：

• 使用EpiTrack工具分析14.6百万条SARS-CoV-2基因组序列中表位的地理和时间动态。

• MHCvalidator由多层感知机（NN-validator）、抗原加工预测算法（NetMHCpan和MHCflurry）以及肽段序列编码模块（PE）组成。
• 在目标肽段验证中，MHCvalidator集成了预测得分（结合亲和力和抗原加工）和肽段序列特征，大幅提高了PSM的置信度。
• 图中数据显示目标肽段显著多于伪肽段。例如，在HLA A*02:01等位基因的测试中，目标肽段占比超过85%，伪肽段被显著压缩至不足15%。
• 采用“NN-validator + PE + APP”配置，进一步提升了肽段验证效率，尤其在高变异样本中表现优异。

2. MHCvalidator与传统工具对比分析

• 在1%假发现率（FDR）下，MHCvalidator识别了6,050个HLA I类特异性肽段，而Percolator仅识别了4,000个肽段，识别能力提高了约1.5倍。

• Venn图显示，MHCvalidator独特发现1,537个肽段，而Percolator仅有64个未被MHCvalidator发现，表明MHCvalidator在灵敏度和特异性上均有明显优势。

• 在低输入样本（如16倍稀释）中，MHCvalidator的肽段识别数量从稀释条件下的3,250提高至稀释样本的6,500，而Percolator的识别数仅为2,500，灵敏度提升约2.6倍。

• 数据进一步显示，MHCvalidator在低质量谱图的处理上表现更佳，尤其在HLA-C*07:01等位基因中，识别效率提高了5.3倍。

3. SARS-CoV-2表位的分类与免疫原性分析

• MHCvalidator重新分析SARS-CoV-2感染细胞的免疫肽谱数据，发现24个高可信度的HLA I类特异性肽段，比原始方法多出13个。
• 新发现的表位包括：

移码表位： LPYPQILLL（由S蛋白31核苷酸缺失生成），绑定HLA-B07:02和B51:01，结合亲和力为144 nM和66 nM。
非规范翻译表位： RANNTKGSL，频繁出现在变异株中，突变率为7.5%。

• 新的表位分布于S蛋白、nsp3和nucleocapsid等区域，进一步验证其免疫反应潜力。

4. 移码表位在感染者中的分布及生成机制

• RNA测序分析发现，在100,512名COVID-19感染者中，约1,100人（1.1%）存在S蛋白区域的缺失事件。
• 其中，850例患者（~0.85%）携带31核苷酸的+1移码突变，生成表位LPYPQILLL，平均缺失长度为1.3个核苷酸。
• LPYPQILLL绑定于B7超型HLA分子（如B*07:02），约35%的全球人群可能呈递该表位。
• 进一步分析显示，两个关键缺失事件（5’-23649和5’-23657处的单核苷酸缺失）占所有+1移码突变的25%。

5. 表位的免疫原性测试

• 在85%的HLA匹配个体中，MHCvalidator鉴定的表位成功诱导CD8+ T细胞反应，平均反应频率为25%。
• LPYPQILLL表位在B07:02和B51:01匹配个体中引发T细胞反应，分别为14名和12名个体中的1名和5名（反应频率约为7%和42%）。
• RTIKVFTTV表位（A*02:01匹配）在25名患者中诱导了11例免疫反应，反应频率为44%。
• 数据显示，表位结合亲和力（IC50，nM）与反应频率存在中度正相关（r = 0.568）。

6. 疫苗相关表位的突变动态追踪

• 在16个疫苗相关表位中，11个在全球范围内保持高度保守（突变率<1%），如KLPDDFTGC和TLNDLNETL。
• 5个表位表现出显著的突变频率，例如：

• TTDPSFLGRYM的突变未影响其HLA呈递能力，但预测其免疫原性可能受到轻微负面影响，需进一步实验验证。
• 研究强调了对疫苗相关表位的长期突变动态监测的重要性，以应对未来变异毒株带来的免疫逃逸风险。

• 开发了MHCvalidator工具，通过整合多层感知机（NN-validator）、抗原加工预测算法（NetMHCpan和MHCflurry）以及肽段序列编码模块（PE），显著提升了HLA I类肽段的识别灵敏度和准确性。
• 与传统方法（如Percolator）相比，MHCvalidator在1%假发现率下肽段识别效率提高了约1.5倍，尤其在低输入样本和高变异数据中表现出色。

• 通过MHCvalidator鉴定出24个高可信度的SARS-CoV-2表位，包括多个非规范移码表位（如LPYPQILLL）和新发现的病毒蛋白抗原肽段（如RANNTKGSL）。
• RNA测序分析显示，约0.85%的感染者存在导致LPYPQILLL生成的+1移码突变，主要呈递于B7超型HLA分子。

• ELISpot实验表明，85%的新发现表位能够诱导HLA匹配个体的CD8+ T细胞反应，平均反应频率为25%。
• 特定表位（如RTIKVFTTV和LPYPQILLL）在多个患者中展现了强免疫原性，为疫苗设计提供了优先候选靶点。

• 使用EpiTrack工具分析了16个疫苗相关表位的全球和时间动态。11个表位在全球范围内高度保守，突变率<1%，如KLPDDFTGC和TLNDLNETL。
• 部分表位在Delta和Omicron变异株中突变（如TTDPSFLGRYM），但仍保留HLA呈递能力，显示疫苗适应性设计的必要性。