Q1 | 健康乳腺组织单细胞衰老图谱揭示衰老与肿瘤相关的表观遗传与转录组共享特征

衰老是乳腺癌发生的最重要危险因素之一，大约三分之二的病例发生在50岁以上的女性中。然而，目前对衰老如何在细胞和分子层面重塑乳腺组织，从而影响癌症发生的具体机制知之甚少。乳腺组织在一生中经历多次重塑过程（如发育、月经周期、怀孕和哺乳等），其由导管型上皮细胞和间质细胞（包括成纤维细胞、脂肪细胞和免疫细胞）组成。在这些细胞类型中，上皮细胞是乳腺癌的主要起源点。

既往研究已发现衰老相关的上皮细胞比例变化和谱系特异性变化，但对其他细胞类型（如免疫和间质细胞）的了解有限。此外，虽然衰老相关的表观遗传改变已被认为是关键分子驱动因素，但其对转录和细胞身份的具体影响仍需进一步解析。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核染色质可及性测序（snATAC-seq），首次全面分析健康小鼠乳腺组织衰老过程中的基因表达和染色质可及性变化，为揭示衰老与乳腺癌之间的联系提供了重要资源。

1.样本采集

• 收集3月龄（年轻，约20-30岁人类）和18月龄（年老，约55岁以上人类）C57BL/6J雌性小鼠的乳腺组织。

• 样本分组：每组分别包含6只小鼠。

2. 单细胞测序

• scRNA-seq：使用10x Genomics平台检测单细胞转录组，解析乳腺组织中细胞类型及基因表达特征。

• snATAC-seq：检测染色质可及性，探索表观遗传调控机制。

3.数据分析

• 细胞类型注释：基于特征性标志基因，将细胞分为上皮细胞、免疫细胞和间质细胞。

• 差异分析：比较年轻和年老组中差异表达基因（DEGs）及差异可及性峰（DA peaks）。

• 转录因子活性分析：基于chromVar评估不同年龄组中关键转录因子活性。

• 空间转录组学：分析衰老相关细胞类型的空间共定位模式。

4. 结果验证

• 将小鼠乳腺衰老的分子特征与人类乳腺癌转录组数据对比，验证其在肿瘤中的作用。

1:乳腺组织中细胞组成的年龄相关变化

• Luminal AV细胞（Csn3+，Trf+，Mfge8+）和Luminal HS细胞（Esr1+，Cited1+，Prlr+）比例随年龄显著减少。
• Myoepithelial细胞（Krt17+，Acta2+，Myl9+）比例随年龄显著增加。

• Naive T细胞（Cd3d+，Sell+）比例显著减少。
• Plasma细胞（Jchain+）仅在年老组中检测到，显著增加。
• Memory T细胞（Cd3d+，S100a4+）、NK细胞、DC（Cd74+）和巨噬细胞（C1qa+）比例随年龄显著增加。

• Fibroblast（Fn1+，Col1a1+）比例显著增加。
• Pericytes（Rgs5+，Acta2+）比例随年龄减少。
• Vascular细胞（Vwf+，Cdh5+）比例无显著变化。

1）基因表达变化：

• Luminal AV和Luminal HS细胞中约80%的差异表达基因（DEGs）具有细胞类型特异性。

• Luminal细胞上调肿瘤抑制基因（Pygl，Epb41l3），下调核糖体蛋白基因。

• Myoepithelial细胞上调癌症相关基因（Fli1，Prrx1）。

• Interferon-γ相关基因在上皮细胞中显著上调。

2）癌症相关通路激活：

• EMT、mTORC1信号、雌激素应答、p53信号、TNF信号、缺氧和MYC信号通路均显著激活。

• 不同上皮细胞亚群中激活的具体基因有所不同。

3）染色质可及性变化：

• DA peaks集中在癌症相关基因区域（如Pygl、Fli1）。

• Promoter区域的DA peaks占比约25%。

• Luminal AV细胞中JUN和NFκB活性增加，Luminal HS细胞中TP53活性上调。

1）Luminal HS亚群

• Epi-C1细胞比例减少，表达Rcan1（肿瘤抑制基因）。
• Epi-C2细胞比例增加，表达Fxyd2和Tph1（增殖和代谢相关基因）。
• Epi-C3细胞表达Luminal AV和Luminal HS混合标志，比例略有减少，但无统计学意义。

2）Luminal AV亚群

• Epi-C4细胞表达Luminal AV标志基因（Csn3，Mfge8），比例减少。
• Epi-C6细胞比例增加，表达Alox15、Alox12e（炎症和代谢基因）。
• Epi-C7细胞为小型增殖细胞群，表达Mki67、Cdk1

3）Myoepithelial亚群

• Epi-C8细胞比例随年龄显著增加，Krt17、Krt5表达减少。
• Epi-C11细胞表达炎症相关基因（Ccl2，Cxcl10），但主要来源于单个样本。

4. 成纤维细胞的衰老相关变化

1）亚群比例变化：

• Fib-C2细胞比例显著增加，约为年轻组的6倍。
• Fib-C4细胞比例增加，Fib-C0比例略增。

2）基因表达变化：

• Fib-C2细胞上调Fap（癌相关成纤维细胞标志）、Fabp4和Lpl（脂质代谢基因）。
• Fib-C4细胞表达Fn1，显示ECM重塑相关特征。
• 多亚群中上调Cdkn1a、Cdkn2a（衰老标志基因）

3）染色质可及性变化：

• Promoter区DA peaks与TNF信号和炎症通路相关。
• Fibroblast亚群的DA peaks显著富集于癌症相关基因（如Col6a3、Fabp4）。

5.免疫细胞的年龄相关变化

• Naive CD4+和CD8+ T细胞比例减少。
• Gzmk+ T细胞比例增加约30倍，表达Pdcd1、Lag3（衰竭标志基因）。
• γδT细胞和MAIT细胞比例增加约3倍，表达Itgae和Ccl5。

• Gzmk+ T细胞上调炎症基因S100a4、S100a6及化学因子Ccl5。
• 记忆CD4+ T细胞上调CTLA4（免疫检查点基因）。

• Ccl5、Pdcd1、Lag3等基因的染色质可及性增加。
• Gzmk+ T细胞中EOMES转录因子活性显著上调。

6.髓系细胞的年龄相关变化

• M2型巨噬细胞（Cd163+，Mrc1+）比例增加。
• cDC1亚群（Clec9a+，Xcr1+）比例增加。

• 上调抗炎基因（Mrc1）和促炎基因（Ccl2）。
• 单核细胞亚群中S100a8、S100a9显著表达。

• M2巨噬细胞中TNF信号相关基因染色质可及性增加。

7.空间转录组学中细胞共定位模式

• 在组织切片中，衰老相关的Myoepithelial细胞与M2型巨噬细胞和成纤维细胞（Fibroblasts）共定位区域显著增加，表明衰老过程可能通过改变组织微环境增强这些细胞类型之间的相互作用。
• Myoepithelial细胞的标志基因（如Krt17、Prrx1）在共定位区域的表达显著增强。

• Hp（编码Haptoglobin，相关于乳腺癌代谢重编程）和Prrx1（参与EMT和癌症转移）在这些共定位区域内显著上调。
• 该现象可能提示衰老相关的共定位模式在癌前病变或肿瘤发生中的潜在作用。

• 共定位区域中炎症相关基因（如Ccl2和Cxcl10）显著富集，表明老化微环境具有更强的促炎特征。
• 共定位模式还包括IL-6信号的上调，进一步证实这些区域可能是炎症驱动的关键节点，支持癌症发生和微环境重塑。

1）TCGA验证：

• 小鼠乳腺衰老相关的分子特征（如Pygl和Epb41l3）在人类乳腺肿瘤样本中也有显著表达，验证了小鼠模型的可靠性。

• 进一步分析表明，这些基因不仅参与衰老过程，还与乳腺癌的关键病理过程相关联。

• Pygl基因（与糖代谢重编程相关）在肿瘤中的上调可能提示代谢状态的改变，而Epb41l3基因（一个肿瘤抑制因子）的表达可能与肿瘤的应激反应有关。

• EMT（上皮-间质转化）：关键基因（如Snai1和Twist1）的上调与衰老相关基因协同表达，提示衰老细胞可能通过EMT促进癌症的侵袭和转移。
• TNF信号通路：显著上调的炎症基因（如Tnf和Ccl2）表明衰老相关微环境驱动的慢性炎症可能参与乳腺癌的发生。
• 雌激素应答通路：关键基因（如Esr1和Pgr）的激活暗示内分泌信号在衰老相关肿瘤发生中的作用。
• mTOR信号：与肿瘤代谢重塑和细胞增殖相关的mTOR通路在乳腺癌样本中被激活，进一步支持其潜在的致癌作用。

• 在衰老相关的乳腺癌样本中，TP53、NFκB和JUN等关键转录因子的活性显著上调，与炎症、增殖和癌症相关基因表达密切相关。

• 本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单核染色质可及性测序（snATAC-seq），全面解析了小鼠乳腺组织在衰老过程中的细胞组成、基因表达和表观遗传特征变化。结果显示，衰老引发了上皮细胞、免疫细胞和间质细胞的比例及功能变化，其中上皮细胞谱系标志丢失，免疫细胞表现出炎症和衰竭特征，成纤维细胞显示促癌相关分子特性。

• 空间转录组学揭示了衰老相关细胞类型（如Myoepithelial细胞、M2型巨噬细胞和成纤维细胞）在组织中的共定位模式，这些区域富集癌症和炎症相关基因。进一步跨物种分析表明，小鼠乳腺衰老的分子特征在人类乳腺癌中保守，且癌症相关通路（如EMT、TNF信号、雌激素应答）显著激活。