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医学科研新动向
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Circulating tumor-reactive KIR+CD8+ T cells suppress anti-tumor immunity in patients with melanoma
Nature Immunology
<2024年11月28日>
研
究
背
景
肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞是抗肿瘤免疫的核心效应细胞，通过介导肿瘤细胞裂解实现肿瘤清除。然而，黑色素瘤等实体瘤的免疫微环境中，存在多种免疫抑制机制削弱CD8+ T细胞功能，导致肿瘤免疫逃逸。尽管免疫检查点抑制剂（如PD-1和CTLA-4抗体）通过解除T细胞耗竭已显著改善部分患者的临床预后，但大多数患者仍面临治疗失败，提示存在未被充分研究的免疫抑制细胞亚群。本研究通过高分辨率单细胞技术和功能实验，首次系统性鉴定了一类KIR+CD8+ T调节细胞（Treg-like CD8+ T cells），并揭示其在黑色素瘤患者中通过抑制抗原反应性CD8+ T细胞功能促进肿瘤免疫逃逸的作用机制，同时探索其与临床预后的相关性。
研究设计
收集17名免疫治疗的黑色素瘤患者肿瘤组织及外周血样本，采用梯度离心法分离单个核细胞（PBMC）。 利用5′液滴式单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合TCR测序对肿瘤和血液样本的T细胞群体进行高分辨率分析，共获得202,169个单细胞数据点。
2. T细胞反应性与克隆关系分析
使用基因集富集分析（GSEA）评估T细胞的肿瘤抗原反应性，通过TCR序列追踪克隆相关性。
采用UMAP降维分析将CD8+ T细胞分为8个转录群组，按反应性状态划分为肿瘤反应性（Matched reactive）、未反应性（Matched unreactive）及血液特异（Blood only）群体。
3. KIR+CD8+ T细胞鉴定与功能验证
基于特征性基因（如KIR2DL3、KLRD1）表达鉴定KIR+CD8+ T细胞群体，利用多参数流式细胞术分析蛋白表达水平（n=47）。
在体外实验中，将KIR+和KIR− PBMC共培养，并通过CD137表达评估肿瘤抗原反应性T细胞的活性抑制情况。
4. 高通量表位筛选
针对12名患者，构建肿瘤相关抗原肽库（>60,000个10-mer），通过TCR转导细胞系验证KIR+CD8+ T细胞的肿瘤抗原特异性。
5. 预后关联分析
构建Lasso模型，根据KIR+CD8+ T细胞的特征性基因表达量预测其在患者血液中的频率。
结合单细胞测序和流式细胞术数据，评估KIR+CD8+ T细胞频率与三年生存率的关系，并分析其在免疫治疗耐药患者中的变化趋势。
核心结果
1. 循环肿瘤抗原反应性T细胞的克隆扩增与多样性特征
通过scRNA-seq与TCR测序，鉴定出7,183个CD8+ T细胞与肿瘤抗原反应性T细胞克隆相关，占外周血CD8+ T细胞总数的17.8%。这些细胞表现出显著的克隆扩增，扩增比例（log-normalized expansion score）显著高于未反应性T细胞（P = 0.009）和血液特异T细胞（P < 0.001）。同时，反应性T细胞的Shannon多样性指数较低（P < 0.01），提示其克隆限制性较强，反映了抗原驱动的选择性扩增特征。
2. KIR+CD8+ T细胞的转录特征及功能验证
KIR+CD8+ T细胞在肿瘤反应性富集的T细胞亚群中显著富集，表现出高水平的抑制性KIR基因（如KIR2DL3、KIR3DL1）、细胞毒性分子（如PRF1、GZMB）及迁移相关基因（如CX3CR1、CCL5）。相比KIR− CD8+ T细胞，KIR+细胞在Helios、T-bet、Perforin和IFNγ的表达水平上显著升高（P < 0.00001）。体外实验显示，KIR+CD8+ T细胞显著抑制CD137+肿瘤抗原反应性CD8+ T细胞的比例（从3.36%降至1.45%，P = 0.008），而对CD4+ T细胞无显著影响，提示其抑制效应特异性针对CD8+效应T细胞。
3. KIR+CD8+ T细胞的跨组织转录保守性
KIR+CD8+ T细胞的135个特征性基因在肿瘤和血液中的表达高度一致（Spearman’s ρ = 0.659，P = 0.005），且在肿瘤组织中与外周血中的KIR+ T细胞频率显著相关（ρ = 0.583，P = 0.02）。这些细胞在肿瘤组织中还表达高水平的激活相关基因（如CD69、LAG3）和组织驻留标志物，提示其可能在肿瘤微环境中维持抑制功能。
4. KIR+CD8+ T细胞的肿瘤抗原特异性
高通量表位筛选验证了3个KIR+CD8+ T细胞克隆（TCR2328、TCR2409、TCR2647）具有明确的肿瘤抗原特异性，对应抗原包括MAGE-A1、MELOE-1和SORL1衍生的新抗原。这些克隆在肿瘤和血液中均可检测到，进一步证实其在循环与肿瘤间的克隆一致性。
5. KIR+CD8+ T细胞与患者预后之间的关联
使用Lasso模型对患者进行分类后，发现KIR+CD8+ T细胞频率高的患者三年生存率显著降低（P = 0.037）。在免疫治疗耐药患者中，KIR+CD8+ T细胞比例显著高于未经治疗的患者（20.5% vs. 15.8%，P = 0.05），提示其可能是治疗抵抗的重要机制。此外，Lasso Logistic模型在预测肿瘤反应性KIR+CD8+ T细胞时表现出较高的准确性（AUC = 0.867）。
小
结
本研究通过高分辨率单细胞技术揭示了一类新型的KIR+CD8+ T调节细胞（Treg-like CD8+ T细胞），这些细胞在黑色素瘤患者的血液和肿瘤微环境中发挥重要作用。研究表明，KIR+CD8+ T细胞虽然表现出肿瘤抗原特异性，但却通过抑制肿瘤抗原反应性CD8+ T细胞的效应功能，促进肿瘤的免疫逃逸。该亚群的特征性基因在肿瘤和血液中高度保守，且与患者的临床预后密切相关。特别是高频率的KIR+CD8+ T细胞与较差的三年生存率显著相关，提示这一细胞群可能是肿瘤免疫抑制的关键因素。通过高通量表位筛选，研究还验证了部分KIR+CD8+ T细胞对肿瘤抗原的反应性，进一步支持其在肿瘤免疫中的重要角色。
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