Q1 | 增强线粒体单碳代谢缓解阿尔茨海默病病理机制研究：基于果蝇模型、细胞实验和遗传学分析的探索

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）是最常见的老年神经退行性疾病，全球范围内AD患者人数预计将在2050年超过1.5亿。其典型病理特征包括毒性淀粉样β肽（Aβ）的聚集、神经元丢失及线粒体功能障碍。虽然Aβ的清除已被探索为治疗策略，但单一靶点策略存在局限性。近年来，线粒体作为细胞能量代谢、信号传递和氧化应激调控的中心，其功能障碍被认为是AD病理的重要因素之一。线粒体内的单碳（1C）代谢依赖于叶酸途径，负责关键的核苷酸、氨基酸和辅酶合成。该代谢途径与复合物I紧密相连，提供电子传递所需的NAD(P)H。然而，目前尚不清楚线粒体1C代谢在AD中具体发挥的作用，以及是否可以通过增强该路径改善AD病理。本研究通过果蝇模型结合蛋白质组学、遗传分析和药理干预，系统评估增强线粒体1C代谢对AD的神经保护作用，提出叶酸代谢增强作为潜在治疗策略的科学依据。

1.果蝇AD模型：

• 利用果蝇表达毒性Aβ-Arc突变体（Aβ1-42含Glu22Gly突变）模拟AD病理，检测其对线粒体功能和代谢的影响。

• 采用视网膜光感受器神经元和寿命评估验证神经保护效应。

2.遗传学和药理学干预：

• 通过果蝇线粒体1C代谢关键酶Nmdmc的过表达和RNA干扰研究其在神经保护中的作用。

• 使用叶酸代谢捐赠体（甲酰四氢叶酸，FiA）进行药理干预实验。

3.Mendelian随机化分析：

• 基于人类遗传数据评估MTHFD2L（Nmdmc同源基因）表达水平与AD风险之间的因果关系。

• 使用UK Biobank和GWAS数据关联叶酸摄入与AD病理风险。

4.蛋白质组学分析：

• 采用LC-MS/MS技术对Aβ-Arc表达果蝇进行定量蛋白质组学检测，分析线粒体功能相关蛋白的变化。

• 利用主成分分析（PCA）和功能富集分析解释蛋白质变化的生物学意义。

5.线粒体功能检测：

• 复合物I活性测定：通过NADH氧化速率反映复合物I功能。

• 线粒体膜电位Δψm：采用TMRM荧光染料检测线粒体膜极化状态。

• ROS水平：利用MitoSOX红色荧光指示剂测定线粒体活性氧。

6.代谢物分析：

• 通过高分辨率质谱检测叶酸、甲硫氨酸及其他1C代谢相关分子的水平变化。

7.行为和寿命评估：

• 果蝇爬升实验：评价运动能力。

• 睡眠模式分析：基于连续行为记录，定义不动持续超过5分钟为睡眠。

1）蛋白质组学结果概览

• 定量蛋白质组学分析揭示，在表达毒性Aβ-Arc的果蝇中，1578种蛋白发生显著变化，占检测总数（4822种蛋白）的33%。

• 功能富集分析表明，这些变化显著集中于线粒体功能相关的两个关键途径：

• 线粒体复合物I：NADH脱氢酶的多个亚基（如Ndufs2、Ndufv2）显著上调。

• 单碳代谢途径：二氢叶酸还原酶（Dhfr）和腺苷高半胱氨酸酶（Ahcy13）水平显著升高。

2）主成分分析（PCA）

• PCA显示，第一主成分（PC1）解释了79.8%的蛋白质组差异，强调了复合物I和单碳代谢在Aβ-Arc诱导的代谢重塑中的关键作用。

• PCA的功能富集结果表明，毒性Aβ-Arc表达主要影响电子传递链（复合物I）和单碳代谢相关蛋白。

3）复合物I蛋白成分的变化

• 复合物I的亚基（如Ndufs7）显著上调。

• 虽然蛋白水平增加，但功能性验证（见Fig. 2）提示这些改变未能有效提升复合物I活性。

1）复合物I活性显著下降

• 复合物I依赖的NADH氧化活性在Aβ-Arc果蝇中显著下降，活性减少约40%（P < 0.001）。

• 功能下降提示复合物I的蛋白上调可能与组装或功能耦联效率降低有关。

2）NADH水平升高

• 果蝇头部NADH总浓度显著升高（约20%，P < 0.01），与复合物I氧化活性下降直接相关。

• 提示毒性Aβ-Arc表达引发氧化还原代谢失衡。

3）关键代谢物水平下降

• 叶酸和甲硫氨酸水平分别下降约25%和18%（P < 0.01）。

• 生物素（另一个关键单碳代谢物）也出现显著减少。

• 虽然单碳代谢酶（如Dhfr）水平上调，但底物耗竭表明单碳代谢网络未能维持正常功能。

3. Nmdmc过表达改善复合物I功能并恢复线粒体健康

1）复合物I功能恢复

• 在Aβ-Arc果蝇中过表达线粒体单碳代谢关键酶Nmdmc，复合物I的NADH氧化活性显著提升（约30%，P < 0.01）。

• 活性恢复至接近对照水平，表明Nmdmc对线粒体功能有直接改善作用。

2）线粒体膜电位恢复

• Nmdmc过表达显著提高线粒体膜电位Δψm（P < 0.001），反映线粒体能量代谢功能的修复。

3）ROS生成减少

• Aβ-Arc诱导的线粒体ROS水平下降约50%（P < 0.01），显示Nmdmc能够有效缓解氧化应激。

4）线粒体结构改善

• 超微结构分析显示，Nmdmc过表达减少了线粒体嵴碎片化（比例从36%降至18%，P < 0.01）。

• 线粒体形态恢复至接近正常水平。

1）寿命延长：Aβ-Arc果蝇的寿命显著延长约20%（P < 0.001）。

2）运动能力增强：爬升实验中，果蝇运动能力显著提高（爬升指数从0.3升至0.6，P < 0.01）。

3）神经保护作用：Nmdmc过表达显著减少视网膜光感受器神经元退化比例，退化比例下降约50%（P < 0.05）。

4）Tau蛋白毒性模型验证：在Tau蛋白诱导的神经毒性果蝇模型中，Nmdmc过表达显著提高Δψm水平（P < 0.001）并减少神经元退化。

• 孟德尔随机化分析表明，MTHFD2L表达每增加一个标准差，AD风险降低2.2%（β = -0.022，P < 0.00001）。
• 兴奋性和抑制性神经元中均观察到类似的保护效应（P < 0.01）。

• 线粒体膜电位恢复：FiA补充逆转了Aβ1-42诱导的线粒体Δψm丧失（P < 0.01）。

• ROS水平下降：FiA处理显著减少ROS生成（P < 0.05）。

• 线粒体形态改善：FiA处理减少线粒体形态异常，尤其是线粒体长度缩短现象（P < 0.05）。

• 寿命延长：FiA处理延长Aβ-Arc果蝇寿命约15%（P < 0.01）。

• 神经保护作用：FiA减少神经退化比例（P < 0.05），并显著改善运动表现。

8.叶酸摄入与AD风险显著负相关

• 遗传数据支持：GWAS数据显示，高叶酸摄入显著降低AD风险（OR = 0.85，P < 0.01）。

• 脑容量和认知功能改善：高叶酸摄入与海马灰质体积增加（P < 0.01）及认知功能提升相关（P < 0.05）。

1. Aβ-Arc表达重塑线粒体代谢网络

• 通过蛋白质组学分析，研究发现毒性Aβ-Arc的表达导致复合物I（NADH脱氢酶）和1C代谢相关蛋白的显著上调。然而，这些蛋白水平的增加未能转化为复合物I活性的提升，提示Aβ-Arc可能通过干扰复合物I组装或功能耦联引发线粒体功能障碍。

2. Aβ-Arc诱导复合物I活性下降及关键代谢物耗竭

• Aβ-Arc表达显著降低复合物I的NADH氧化活性，同时引发线粒体NADH积累和氧化还原代谢失衡。此外，叶酸和甲硫氨酸等1C代谢关键底物水平显著下降，导致代谢通路效率受限。

3. Nmdmc过表达恢复线粒体功能并缓解神经毒性

• 通过过表达线粒体1C代谢关键酶Nmdmc，成功恢复复合物I活性和线粒体膜电位（Δψm），并显著降低ROS生成和线粒体结构损伤。Nmdmc还有效缓解神经元退化，提高果蝇寿命和运动功能，其在Tau毒性模型中同样展现神经保护效应。

4. Mendelian随机化分析验证MTHFD2L的保护作用

• 人类遗传数据分析表明，MTHFD2L表达水平升高与AD风险显著降低相关（β = -0.022，P < 0.00001），这一发现支持增强线粒体1C代谢作为干预策略的潜在可行性。

5. 叶酸补充在细胞和动物模型中展现保护效果

• 药理学实验显示，叶酸代谢捐赠体（FiA）补充有效恢复细胞模型中的线粒体功能，显著改善果蝇AD模型的寿命、神经退化及运动能力。

6. 叶酸摄入与AD风险的负相关性

• 基于GWAS和孟德尔随机化分析，研究进一步证实高叶酸摄入与较低的AD风险显著相关（OR = 0.85，P < 0.01），并观察到脑容量增加和认知功能改善，强调了叶酸代谢增强的潜在临床意义。