多组学联合分析揭示非小细胞肺癌亚型特征与免疫微环境的新蓝图

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占85%以上。传统上，NSCLC主要根据组织学分为肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LSCC），但单一的组织学分类无法准确反映肿瘤的生物学异质性。

近年来，高通量组学技术的兴起使得通过分子特征重新分类癌症成为可能。例如，TCGA已将LUAD分为终末呼吸单元型和近端炎性型等亚型，而LSCC则被分为经典型和原始型等。然而，这些分类体系大多基于单一组学数据，忽视了分子特征与肿瘤微环境的复杂互动。此外，NSCLC患者的治疗效果与预后显著受肿瘤分子特征影响，但现有治疗决策缺乏分子分型支持。

基于上述问题，本研究通过整合多组学数据（基因组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白组、乙酰化蛋白组），旨在全面解析NSCLC的分子特征。目标是识别具有预后和治疗意义的分子亚型，并揭示其生物学基础。

多组学数据整合与亚型分析

1. 队列选择与样本来源

• Korean NSCLC队列：研究分析了来自韩国229例NSCLC患者的肿瘤组织和配对的正常组织样本，收集了其临床特征、手术数据及随访信息。

• 验证队列：包括462例患者，来自以往多组学研究的LUAD和LSCC样本。

2. 数据获取与处理

• 基因组数据：通过全外显子测序（WES），获得每例患者的单核苷酸变异（SNV）、插入缺失（InDel）、拷贝数变异（CNV）等。

• 转录组数据：采用RNA测序（RNA-Seq），分析基因表达量和可变剪切事件。

• 蛋白质组数据：利用串联质谱（TMT标记）获得蛋白表达量，同时分析磷酸化和乙酰化修饰特征。

3. 亚型分类方法

• 使用非负矩阵分解（NMF）算法，整合多组学数据以聚类分析NSCLC分子亚型。

• 每个亚型的特征通过通路富集分析（GSVA）和分子网络分析进行注释。

4. 微环境与临床相关性分析

• 整合单细胞RNA测序数据，评估每个亚型的肿瘤微环境（TME）特征。

• 分析亚型与患者预后、肿瘤转移及治疗响应的关系。

1：NSCLC分子亚型的多组学识别

• 通过非负矩阵分解（NMF）分析229例韩国NSCLC患者的多组学数据（基因组、转录组和蛋白质组），识别出五种分子亚型：代谢型（Subtype 1）、肺泡样（Subtype 2）、增殖型（Subtype 3）、缺氧型（Subtype 4）和免疫型（Subtype 5）。

• Subtype 1：患者主要为女性LUAD（64%，35/55），伴EGFR和TP53突变以及全基因组加倍（WGD）事件，其CDKN2A拷贝数丢失（OR = 3.63, P = 2.35 × 10⁻²）。
• Subtype 2：71%为LUAD（32/45），无WGD事件，EGFR突变占49%（22/45），TP53突变比例最低（6%，P = 3.1 × 10⁻⁹）。
• Subtype 3：65%为LSCC（34/52），伴高频TP53突变（OR = 13.5, P = 4.6 × 10⁻¹⁰）和PIK3CA突变（OR = 3.89, P = 3.16 × 10⁻²）。
• Subtype 4：转移风险最高（OR = 3.0, P = 5.6 × 10⁻³），富含缺氧相关蛋白和PI3K-Akt信号激活（P = 4.7 × 10⁻³）。
• Subtype 5：免疫富集型，TIL相关模式显著（OR = 3.6, P = 1.2 × 10⁻²），伴KRAS突变（OR = 4.51, P = 3.53 × 10⁻²）。

2：多组学亚型的验证与预后分析

1）亚型验证：

• 在验证队列（462例患者，包括LUAD和LSCC）中，发现五种亚型的特征具有跨队列的一致性，其中Subtype 4保持了与原始队列相似的分子和临床特征，占18.3%的样本（40/218）。

2）预后关联：

• Subtype 4患者的总体生存率显著低于其他亚型（P = 0.0084，log-rank检验）。

• 高磷酸化SLK (S347) 和LRRFIP1 (S581)的表达在Subtype 4中显著富集，分别与不良预后相关（P = 3.0 × 10⁻⁶和P = 1.2 × 10⁻³，log-rank检验）。

• 尽管Subtype 4具有最高的转移率（35例有转移，8例无转移），但生存分析显示转移本身不是其不良预后的唯一原因（P = 0.95）。

1）单细胞转录组分析：

• Subtype 1和Subtype 3富含与增殖相关的LUAD和LSCC肿瘤细胞；Subtype 4和Subtype 5显著富含肿瘤相关中性粒细胞（TAN），其中Subtype 5的免疫浸润最为丰富。

2）组织学验证：

• Subtype 2的肿瘤呈现正常肺泡样结构，伴有低级别病理学模式（如腺泡型和乳头状结构）。

• Subtype 4显示中等至大量的基质成分和炎症细胞浸润，而Subtype 5在约50%的样本中呈现免疫细胞密集浸润的热点模式。

• Subtype 1和Subtype 3中高等级病理学模式（如实体型和复杂腺体型）占主导。

1）WGD分布：

• Subtype 1和Subtype 3中WGD事件比例最高，分别为51%（28/55）和75%（39/52）。

• WGD事件与染色体3q扩增（Subtype 3，OR = 16.4, Fisher’s检验）和细胞周期基因突变（如SOX2和TP53）密切相关。

2）分子特征：

• Subtype 1中EGFR通路相关基因显著上调（如CDK1和CDK4，FDR < 0.1），显示快速细胞增殖特性。

• Subtype 3中，SOX2、GSK3B等3q基因扩增驱动WGD，伴随较高的肿瘤突变负担（TMB）。

3）药物敏感性：

• Selinexor（XPO1抑制剂）在Subtype 3的类器官实验中显著抑制细胞增殖，显示其潜在的治疗价值。

1）免疫热点和冷点：

• Subtype 5表现为免疫热点（HTE），富含CD8+ T细胞、B细胞和NK细胞，这些特征与更好的生存率相关（P < 0.01）。相反，Subtype 4中的TAN比例最高，提示其炎症与促转移特性。

2）免疫通路活性：

• HTE亚型中免疫通路（如TNF-α信号通路和NF-κB信号通路）显著激活，而冷点（CTE）亚型中代谢相关通路占主导。

3）预后影响：

• 免疫热点状态与较好的总体生存率相关，而Treg细胞的高富集可能削弱其抗肿瘤效应。

1）新抗原负担分布：

• Subtype 5（免疫型）新抗原负担最高，提示其强免疫活性，与更好的生存率相关（P < 0.01）。

• Subtype 4（缺氧型）新抗原负担最低，但隐性MAPs显著富集，与缺氧相关信号和转移特性相关。

2）隐性MAPs与预后关联：

• Subtype 5中的隐性MAPs与免疫激活通路相关，可能通过增强抗原呈递刺激免疫反应。

• Subtype 4的隐性MAPs可能促进免疫逃逸和侵袭，导致较差的预后。

3）治疗潜力：

• Subtype 5的新抗原为免疫检查点抑制剂和个体化疫苗开发提供潜在靶点。

• Subtype 4的隐性MAPs可能结合缺氧信号靶向治疗以增强免疫应答。

4）分子通路关联：

• 新抗原负担与免疫通路（如TNF-α和NF-κB通路）显著正相关。

• 隐性MAPs在Subtype 4中与PI3K-Akt和HIF-1通路显著关联。

本研究通过整合多组学数据（基因组、转录组、蛋白质组等），对非小细胞肺癌（NSCLC）进行了分子亚型的系统解析，识别出五种具有特异性临床和生物学特征的亚型。这些亚型不仅在分子特征上高度异质，还表现出显著的免疫微环境差异及治疗反应性。

1）分子亚型的识别：

• 五种分子亚型（代谢型、肺泡样、增殖型、缺氧型和免疫型）展现了从染色体不稳定到免疫热点等不同的肿瘤特征，提示肿瘤异质性的复杂性。

• Subtype 5（免疫型）：免疫浸润显著，具有高新抗原负担，与良好预后相关。

• Subtype 4（缺氧型）：转移率高，新抗原负担低但隐性MAPs显著，预后最差。

2）肿瘤微环境的异质性：

• 亚型在肿瘤相关中性粒细胞（TAN）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）及其免疫活性通路上存在显著差异。

• Subtype 5的免疫热点特征表明其适合免疫治疗，而Subtype 4表现为免疫逃逸特性。

3）全基因组加倍（WGD）及增殖特性：

• WGD事件在Subtype 1（LUAD）和Subtype 3（LSCC）中显著富集，驱动了细胞周期基因和染色体变异的激活，为潜在治疗靶点提供了基础。

4）新抗原与隐性MAPs的临床意义：

• 新抗原和隐性MAPs在不同亚型中的分布揭示了免疫激活与逃逸机制。Subtype 5中高新抗原负担为免疫检查点抑制剂和个性化疫苗提供靶点，而Subtype 4的隐性MAPs结合缺氧相关通路的靶向治疗具有开发潜力。