孕二烯酮避孕微针的制备和评价

      孕二烯酮（GEST）是第三代孕激素，孕激素活性较强，广泛用于女性避孕，避孕效果良好［1-2］。GEST避孕的市售制剂主要是口服制剂，为复方短效口服避孕药，需每天服用，使用者的顺应性较差，且血药浓度波动范围较大，容易引起副作用［3］。为此，研究者们进行了许多非口服制剂的研究，包括宫内节育器（IUD）、注射剂、阴道环、贴剂等剂型的研究［4-10］。透皮贴剂Apleek缓释制剂，贴片的贴敷面积较大，贴敷时间长(7d)，易对皮肤造成一定的刺激，使用者的耐受性差，严重限制了其应用范围。微针是一种新型的透皮给药技术，通过穿刺角质层而将药物输送至皮下，更好地发挥药效，同时又不会触及痛觉神经［11］。微针经过多年研究，其种类繁多，包括金属微针、硅微针、聚合物微针，其中金属微针和硅微针容易断裂，断裂的针体会长期留置于皮肤中，因此具有一定的风险。而聚合物微针采用的可降解的高分子生物材料，安全性较高。因此，近年来微针制剂的研究热点集中在聚合物微针的研究和开发。其中溶解微针选用可降解聚合物材料［12-15］，针体刺入皮肤后，药物随着可降解聚合材料溶解在皮下组织液中，逐渐被机体吸收。本研究以溶解性高分子材料PVPK90为基质，采用模具法，将GEST制备成溶解微针，并研究了GEST避孕微针的机械性能、刺穿能力和溶解速度，以及了微针贴片中药物的体外释放曲线。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

      Waters 2695-2487高效液相色谱仪（美国Waters公司）；TK-24BL型透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司）；RT 5 power多点加热磁力搅拌器（德国IKA）；Leica LMD6000显微镜（徕卡仪器有限公司）。GEST原料药（秦皇岛紫竹药业有限公司，批号92801510001）；PVPK30（博爱新开源制药股份有限公司，批号P160307002-1）；PVPK90（博爱新开源制药股份有限公司，批号P160305001-1）；CMC Na（西安百川生物科技有限公司，批号9004-32-4）；硫酸软骨素（西安百川生物科技有限公司，批号9007-28-7）；GEST标准品（中国食品药品检定研究院，批号41008-201301）；幼猪猪皮（上海锴凯科技贸易有限公司）；乙腈（Thermo公司，批号112189）为色谱级；实验用水为自制纯净水，其他试剂均为分析纯。动物：SPF级别的SD雌性大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），体重200~220g，适应环境3d，给药前12h禁食不禁水。

1.2 GEST微针的制备

1.2.1 GSET微针的处方优化    ①基质材料选择：分别称取适量CMC Na、硫酸软骨素、PVPK30和PVPK90置于不同的锥形瓶中，加入适量的水进行溶解或溶胀。移取100 μl上述不同种类的基质溶液于模板上，真空干燥30min，室温干燥过夜，次日取下微针贴片，观察微针贴片的形貌特点和柔韧性。②基质溶液的浓度：称取适量PVPK90置于不同的锥形瓶中，加入适量水，搅拌，静置，溶胀，配制成100、150、200 mg/ml的基质溶液，再将适量原料药加入到基质溶液中，使用磁力搅拌使药物混合均匀。分别移取适量不同浓度的基质溶液于模板上，真空干燥30min，室温干燥过夜，次日取下微针。

1.2.2 GSET制备工艺优化    GEST避孕微针的制备工艺图如图1（封三）所示：称取适量PVPK90于水中，静置使其溶解溶胀，再将原料药加入到基质溶液中，使用磁力搅拌使药物混合均匀成混悬状态。移取适量混合液于模具上，真空干燥，室温干燥过夜，次日脱模即可得到微针贴片。但在制备过程中会出现空心针体，因此从加样体积和真空干燥时间两个方面解决微针的空心问题。①加样体积：按照上述方法制备微针，移取100、150、200 μl基质溶液于模板上，真空干燥，然后室温干燥过夜。次日取出微针贴片，置于显微镜下观察其形貌。②真空干燥时间：按照上述方法制备微针，每次真空干燥的时间分别为30、45、60min，考察3种不同真空干燥时间对微针形貌的影响。

1.3 GEST微针的体外药物释放研究

      GEST微针贴片的体外释放研究采用改良的Franz立式扩散池，上面为给药池，下面为药物释放接收池。取适量大小的猪皮肤，将其浸泡在20%PEG400(pH=7.4)缓冲液中平衡30min，然后用滤纸擦干猪皮角质层上的水，并将其固定在给药池和接收池之间。猪皮的角质层朝向给药池，接收池的有效透过面积是1cm2，接收液的体积为8ml，接收池中搅拌子的转速为300rpm，恒温水浴的温度为（37±0.2）℃。每隔24h将样品全部取出，经0.45μm滤膜过滤，于4℃冷藏备用，并补入等体积的接收液。待全部样品取出后，采用HPLC色谱仪进行测试并进行数据处理，得到GEST的体外释放曲线。

1.4 GEST微针穿刺皮肤的性能考察

1.4.1 离体皮肤穿刺     采用自制微针进针器（30N/cm2）将GEST缓释微针作用于离体幼猪皮肤上，然后去除微针，将针刺后的皮肤上加入适量台盼蓝溶液（5mg/ml）染色，静置15min，用蒸馏水冲洗掉多余的台盼蓝溶液，观察皮肤的染色结果。

1.4.2 离体皮肤穿刺断面形态观察    采用自制的进针器将GEST微针贴片作用于离体猪皮肤上，然后移除微针。将猪皮肤即刻放入液氮罐罐口处速冻，采用口服避孕药（OCT）包埋剂包埋，冰冻切片机切片（10 μm），室温干燥20 min。对切片进行HE染色，将切片置于蒸馏水水化5 min，苏木素染色3 min，蒸馏水洗去多余染料，盐酸乙醇分化10s ，蒸馏水洗片3 min，自来水流水返蓝10 min，伊红染色3 min，蒸馏水洗片2次，脱水，透明［75%乙醇10 s-95%乙醇（Ⅰ）10 s-95%乙醇（Ⅱ）30 s-无水乙醇（Ⅰ）30 s-无水乙醇（Ⅱ）2 min-二甲苯（Ⅰ）3 min-二甲苯（Ⅱ）5 min］，中性树胶封片，通风阴凉处干燥，并进行光学显微镜观察。

1.5 GEST微针在大鼠皮肤内的溶解速度测试

      选用200g左右的SD大鼠，腹部脱毛后正常饲养1d，然后通过自制的微针进针器将GEST微针贴片刺入大鼠皮肤内，并用医用胶布固定，于2min取下微针贴片，在显微镜下观察微针的形貌特征。

1.6 GEST微针的力学性能测试

      采用力量-行程测试仪对GEST微针贴片的机械性能进行考察，将单片微针平整置于不锈钢平台上，针尖朝上，对准上方的传感器探头。传感器探头（2mm×2mm）以1.1mm/s的速度向下移动，垂直于微针阵列轴线方向对其施加轴向力，力量上限为5N，记录微针阵列的力量-行程位移曲线图。

2 结果

2.1 GEST微针的制备

2.2.1 微针的处方优化    ①基质材料的选择：CMC Na微针成型性很差且无法脱模，较高浓度的硫酸软骨素基质溶液具有一定的成针性，PVPK30制备的微针硬度较大，柔软性较差，针体较脆，不适合作为微针的基质，PVPK90微针成形性良好，且具有一定的柔韧性，因此选择PVPK90为微针制备的最佳基质材料。②基质溶液的浓度：100 mg/ml的PVPK90基质溶液制备的微针过软，200 mg/ml的基质溶液制备的微针成形性差，150 mg/ml的PVPK90基质溶液制备的微针具有良好的柔软度，能形成良好的微针，所以选择PVPK90基质溶液的最佳浓度为150 mg/ml。

2.2.2 微针的制备工艺优化    ①加样体积：结果表明加入150、200μl基质溶液制备的微针的空心问题基本解决，为提高药物的利用率，减少药物浪费，PVPK90基质溶液选择的加样体积为150μl。②真空干燥时间：将称量好的PVPK90加入到水中，静置使其溶解溶胀，再将原料药加入到基质溶液中，使用磁力搅拌使药物混合均匀成混悬状态。移取140 μl基质溶液于模板上，分别真空干燥30、45、60 min，室温干燥,干燥结束后进行脱模。用显微镜观察微针的成型情况，结果表明真空干燥时间为45、60 min制备的微针的空心问题基本解决，最终选择真空干燥时间为45 min。处方和制备工艺优化后的微针贴片在显微镜下的观察结果如图2（封三）所示，可以清晰地看见四棱锥形状的针体，且针体尖锐，针体组织结构紧致密实，表明GEST微针贴片的制备方法合理。

2.3 GEST微针贴片的体外透皮释放

     GEST缓释微针在体外透皮实验的结果表明，GEST可以缓慢持续释放7d，平均释放速率为20μg/cm2。不同载药量和不同含量PVPK90处方组成的微针贴片对药物体外透皮释放的影响如图3~5所示。图3表明微针的载药量增加，药物的体外透皮释放量增加。图4和图5表明PVP K90用量减小，药物的体外透皮释放曲线更加平稳，f2为26.9，有显著区别；而且PVPK90含量小的微针贴剂的体外透皮释放数据之间误差小，释放曲线比较平行。此外，通过对含有不同处方量PVPK90的微针的释放曲线进行拟合，结果如表1所示，含有70%（w/w）PVPK90的微针的释放曲线符合零级释放，而含有80%（w/w）PVPK90的微针的释放曲线符合Higuchi释放。分析原因可能为含80%（w/w）PVPK90的微针贴片，制备过程中基质溶液的黏稠度较大，导致微针贴片中药物分布并不完全均匀，致使药物释放曲线差异较大；而70%（w/w）PVPK90的微针贴片，黏稠度合适，药物可以均匀分散在高分子基质溶液中，因此制备的微针的体外透皮释放曲线差异较小。综上所述，确定了该微针的最佳处方组成：GEST载药量为32%（w/w），PVPK90基质浓度为70%（w/w）。

2.4 GEST微针穿刺皮肤的性能考察

2.4.1 离体皮肤穿刺    如图6（封三）所示，表明微针能够成功穿透皮肤角质层，穿刺效率>95%。

2.4.2 离体皮肤穿刺断面形态观察    如图7（封三）所示，可以观察到微针可以将离体皮肤的角质层穿透进入皮内。

2.5 GEST微针在大鼠皮肤内的溶解速度测试

     结果如图8（封三）所示，2min时微针贴片的针体基本溶解。

2.6 GEST微针的力学性能测试

     GEST微针的力量行程位移曲线如图9所示，每根针承受的轴向力为（0.32±0.1）N/根，大于文献报道的微针对于正常皮肤的最小穿刺力0.058N/根，表明该微针具有足够的硬度刺穿皮肤角质层，将药物递送到皮肤内层。

3 讨论

3.1 微针的制备

     筛选基质材料时，选用了溶解微针常用的几种聚合物材料：CMC Na、硫酸软骨素、PVPK30和PVPK90进行比较，由于所选模具的性质不同，本试验中能成功制备微针的基质材料为硫酸软骨素和PVPK90，考虑到基质材料的经济成本问题，选择PVPK90作为本试验的基质材料。制备方法优化中对主要影响因素加样体积和真空干燥的时间进行了考察，解决微针制备过程中的空心问题，最终选择150μl加样体积和真空干燥45min为最佳制备工艺。在此研究基础上制备的微针贴片形貌完整，具有良好的机械度和一定的柔韧度，能够保证微针贴片在实际应用中更好地发挥药效。

3.2 微针的体外透皮释放

     GEST缓释微针在体外的透皮实验结果表明，GEST可以缓慢持续释放7d，平均释放速率为20μg/cm2。GEST缓释微针的体外透皮释放试验从载药量和基质溶液的浓度两方面对微针的释放度进行初步的比较，在载药量方面，不断增大微针的载药量，释放速率增加，考虑到过高的载药量对制备工艺的影响，目前选择的载药量为32%（w/w）。基质溶液的黏稠度随着基质溶液浓度的增加而增大，黏度过大会导致微针贴片中药物分布不均匀，致使药物释放曲线差异较大，因此选择合适黏度的基质溶液是至关重要的，研究中选择70%（w/w）PVPK90基质溶液，黏度合适，药物可以均匀分散在高分子基质溶液中。

3.3 微针穿刺皮肤的性能

      为考察制备的GEST微针穿刺效果，通过将离体幼猪皮肤进行微针穿刺后进行台盼蓝染色，观察离体皮肤穿刺断面形态。台盼蓝为细胞活性染料，若微针成功刺穿皮肤角质层时，针孔处则被染为蓝色，试验结果证实染色后的皮肤上蓝色孔洞达到95%以上，穿刺成功。此外根据离体皮肤穿刺后冷冻切片和HE染色后切片均证实微针能够成功穿刺离体皮肤，由此可见GEST缓释微针达到预期成果。

3.4 微针在皮肤内内的溶解性能

     微针针体在皮肤内溶解速度较快，仅需要2min。所以实际应用中微针在人体的贴敷时间较短，使用者的耐受性较好。

3.5 微针力学性能

      在微针负重载荷位移曲线中，未观察到明显的转折点，表明在此力测试范围内，针尖未出现折断线性。结果表明GEST微针针尖具有较强的柔韧性，不易断裂，提高了微针的使用效率。

     本研究以PVPK90作为基质材料，设计了一种含有GEST的避孕微针，制备方法简单，机械强度和柔韧度良好，能够穿刺皮肤角质层进入皮内，穿刺效率达95%以上，表明该微针可以有效地将避孕药物地送至皮下组织中。GEST缓释微针在体外的透皮实验结果表明，GEST可以缓慢持续释放7d，平均释放速率为20μg/cm2。该微针在大鼠体内的溶解速度较快，提高了使用者的耐受性。总之，该研究为女性提供了一种更为便捷的避孕方式的选择。当然，该研究还需进行更多的深入研究，比如，将继续进行微针制剂在大鼠体内的药代动力学研究，比较其与口服给药和皮下注射给药的体内吸收情况，考察GEST缓释微针在大鼠体内的生物利用度是否得到提高；处方和制备工艺的放大优化、微针的稳定性研究、微针贴片在人体的药代动力学研究等，以便保证该微针贴剂在实际使用中的安全性和可靠性。