2024年12月，来自富山大学的Tsubasa Shoji等人在JAFC上发表了一篇题为Enhanced Production of Rebaudioside D and Rebaudioside M through V155T Substitution in the Glycosyltransferase UGT91D2 from Stevia rebaudiana的研究性论文。
Abstract
瑞巴苷类（Steviol glycosides, SGs）是甜叶菊（Stevia rebaudiana）叶片中天然无热量的甜味剂。这些二萜糖苷通过将不同数量的单糖，主要是葡萄糖，附加到甜菊糖苷配基上来合成。瑞巴苷（Reb）D和Reb M是高度葡萄糖化的SGs，以其卓越的甜度和感官特性而受到青睐，但它们在甜叶菊叶片中的含量有限。本研究旨在通过改善来自甜叶菊的UDP糖依赖性糖基转移酶UGT91D2的底物特异性和催化效率，来解决Reb D和Reb M生物合成中的瓶颈。对UGT91D2的结构进行了建模，并替换了两个氨基酸残基，Y134和V155，分别位于糖基受体和供体附近。在酿酒酵母中表达UGT91D2V155T显著提高了Reb D和Reb M的产量。此外，在烟草（Nicotiana benthamiana）中的瞬时表达揭示，V155T替代改善了UGT91D2的葡萄糖基化活性，表明该替代增强了UDP-葡萄糖的结合，并减少了涉及非葡萄糖供体的副反应。通过在烟草中共同表达多个甜叶菊UGT基因，成功地从甜菊醇中生产了高度葡萄糖化的SGs。结果为UGT91D2的底物特异性提供了深入的见解，并为SG生物合成的工程化提供了支持。
01
简介
由于过度摄入蔗糖和果糖与健康问题的关联，建立可持续的天然替代高热量糖的供应变得尤为重要。甜叶菊（Stevia rebaudiana）是一种原产于南美巴拉圭的多年生草本植物，隶属于菊科，已成为提供无热量天然甜味剂的宝贵资源。甜叶菊提取物的甜味主要来源于其叶片中大量积累的甜菊糖苷（Steviol glycosides，SGs），这些糖苷占植物干重的10%至30%。这些SGs极其甜美，其甜度是蔗糖的150至300倍。SGs是由四环二萜苷基甜菊醇（Steviol, St）和不同长度的糖链组成的糖苷。糖链主要由葡萄糖（Glc）组成，连接在甜菊醇的C13羟基和C19羧基上，分别称为R1和R2（见图1）。
图1. 甜叶菊糖苷(SGs)及其通过糖基化从甜椒素(St)在甜叶菊中的形成。
甜叶菊叶片中含有多种SGs，其中甜菊苷（Stevioside，Stv）和瑞巴苷A（Rebaudioside A，Reb A）是最丰富的。其他高度葡萄糖化和分支的SGs，如瑞巴苷D（Reb D）和瑞巴苷M（Reb M），具有更强的甜度和更优的感官特性，但在甜叶菊叶片中的含量极低（干重的0.3%至0.4%）。随着瑞巴苷D和瑞巴苷M在食品和饮料工业中的使用日益增加，先进的技术，如重结晶、色谱法和膜分离，已成为从粗制甜叶菊提取物中提纯这些特定SGs所必需的。因此，传统育种和转基因方法旨在提高甜叶菊植物中目标甜味SGs的含量，已成为研究的主要方向。
SGs的生物合成涉及甜菊醇（St）的二萜化合物形成，随后是糖基化反应。一个糖基化反应网络通过四种UDP糖依赖性糖基转移酶（UGTs）——UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2和UGT76G1——生成一系列SGs，这些酶均使用UDP糖作为糖基供体（图1A）。目前尚不清楚图1A所示的所有SG的形成是否仅依赖这四种UGT，还是有其他未定义的酶参与其中。酶的多重特性也可能有助于产生少量含有其他单糖（如鼠李糖（Rh）和木糖（Xy））的SG类似物（图1B）。这类含有非葡萄糖部分的SGs通常比其葡萄糖化的同类产品具有较低的甜度和较差的口感。
已有研究表明，UGT85C2和UGT74G1分别在R1和R2位置对甜菊醇（St）进行葡萄糖化。还发现UGT76G1和UGT91D2是糖苷特异性糖基转移酶（GGTs），它们以SGs作为糖基受体。UGT76G1通过β-1,3键合为St附加的葡萄糖分子加上第三个葡萄糖，而UGT91D2则通过β-1,2键合添加第二个葡萄糖。UGT76G1在R1和R2两侧催化糖基化反应，其水疏性腔体能以相反方向容纳SG底物。同样，Oryza sativa（稻米）的UGT91C1（OsUGT91C1），作为UGT91D2的同源酶，其晶体结构已被解析，能够催化SGs在R1和R2两侧的β-1,2糖基化反应。然而，与OsUGT91C1几乎在两侧均等糖基化SGs不同，UGT91D2在R2侧的活性较R1侧低，导致某些SGs在甜叶菊中的积累有限，如瑞巴苷D和瑞巴苷M。
为了增加甜叶菊中商业价值高的SGs（如瑞巴苷D和瑞巴苷M）的生产，解决UGT91D2在R2侧介导的糖基化瓶颈至关重要。为了解决这个问题，基于UGT91D2的结构模型进行了蛋白质工程改造。通过酵母转化技术和在烟草中的瞬时基因表达实验，本研究表明V155T替代显著改善了UGT91D2的糖基供体特异性，从而抑制了不良的副反应，增加了高度葡萄糖化SGs的积累。
02
结果与讨论
1.UGT91D2模型结构
使用UGT91D2的注册序列（GenBank ID：LC835675.1），该序列相比于之前报道的序列，在N末端多了12个氨基酸。UGT91D2与功能相似的水稻OsUGT91C1共享40%的氨基酸序列相似性（56%的相似度）。基于已报道的OsUGT91C1与UDP和S19G复合物的结构（OsUGT91C1:UDP:S19G，PDB ID：7ES1），构建了UGT91D2的模型结构。将糖供体UDP-Glc和糖受体SGs分别对接到UGT91D2和OsUGT91C1结构中（图2）。作为R1和R2侧的糖基化底物，将瑞巴苷（Rub）和甜菊苷（Stv）分别对接到UGT91结构中，Rub和Stv的R1和R2侧分别朝向活性位点腔体底部的催化中心（图2）。报告的OsUGT91C1结构与模拟的UGT91D2结构中UDP和St骨架几乎完全一致，支持了对接模拟的可靠性。
图2. UGT91D2和OsUGT91C1与底物对接的结构。上、下面板分别展示相同的结构，从不同角度观察，重点突出活性位点。
UGT91D2和OsUGT91C1的整体多肽结构高度相似，Cα均方根偏差（RMSD）为0.19 Å。两者都共享相似的活性位点结构，具有相同的催化二联体，由H和D残基组成——UGT91D2中的H38/D133和OsUGT91C1中的H27/D128，位置和取向几乎相同（图2）。催化H残基由D残基稳定，作为一般碱性物质，从糖基受体中抽取质子，在亲核SN2反应机制中起关键作用，这是植物UGTs常见的反应机制。
糖供体UDP-Glc通过与多个氨基酸残基的相互作用，最佳地定向于糖基化反应，其中许多残基位于C末端区域的PSPG（植物二级产品糖基转移酶）盒中（图2）。该区域在植物UGTs中通常是保守的，并在识别UDP-糖的UDP部分时起着至关重要的作用。UDP在UGT91D2和OsUGT91C1结构中的位置几乎一致（图2）。PSPG盒中的不变残基，如UGT91D2中的W355/Q358/E381和OsUGT91C1中的W339/Q342/E365，可能有助于UDP的识别和定位，正如其他UGT结构所报道的那样（图2）。相比之下，UDP-Glc中的Glc部分，在UGT91D2复合物中相较于OsUGT91C1复合物，距离催化中心偏移了2.2和3.0 Å（图2）。在OsUGT91C1中，L150位于UDP-Glc的Glc部分附近，形成一个腔体，为糖基的C5′′-CH2OH基团提供更多的空间，而UGT91D2中的V155则较小（图2）。将UGT91结构叠加后发现，在Rub和Stv结合的复合物中，UGT91D2的V155–Cγ与OsUGT91C1中C5′′-CH2OH的距离分别为2.4和1.9 Å，这可能表明存在空间位阻。UGT91D2中的L150替代为V155，可能会影响Glc部分的定位，从而影响催化活性。
与UDP-Glc相比，糖受体Rub和Stv周围的残基在UGT91D2和OsUGT91C1之间表现出更大的变异性（图2）。这种变异性可能有助于灵活地识别不同的SGs，并允许相同SGs的不同取向。在比较UGT91D2和OsUGT91C1之间SG的位置时，Rub在两种结构中几乎相同地定位（图2A）。然而，Stv，特别是其R2位置的Glc部分（将接受进一步的糖基化），在UGT91D2中相较于OsUGT91C1，向蛋白质方向偏移了2.0 Å（远离催化中心）（图2B）。将Rub和Stv叠加在每个UGT91结构中，可以看到在OsUGT91C1中，两个SG的定位几乎完全一致。而在UGT91D2中，Stv（尤其是其Glc部分）与Rub相比，偏移了2.1 Å，导致Stv相对于催化中心稍远的位置，这可能解释了UGT91D2在R2侧的糖基化受限。UGT91酶之间的多个残基差异（图2）可能有助于对Stv的差异性识别。一个变异残基是UGT91D2中的Y134，该残基位于Stv相关Glc部分附近（图2）。UGT91D2中的Y134替代为OsUGT91C1中的V129，可能在腔体中创造了更多的空间，从而影响SG的识别。
在接下来的部分中将重点讨论UGT91D2中的两个特定残基，V155和Y134，这两个残基被认为在UDP-Glc和SGs的Glc部分识别中发挥重要作用。这些残基的变化可能解释了UGT91酶之间观察到的底物结合差异。V155和Y134的替代可能会显著影响底物识别和酶的催化活性。
2.UGT91D2及其变异体在酵母中的糖基化活性
在实验条件下，遇到了在体外酶测定中稳定纯化重组UGT91D2蛋白的挑战。为了评估Y134和V155位点的氨基酸替代对UGT91D2糖基化活性的影响，在酿酒酵母（S. cerevisiae）中通过表达四种来自甜叶菊的UGTs（UGT91D2或其变异体）及三种其他UGTs（UGT85C2、UGT74G1和UGT76G1），并以甜菊苷的无糖苷部分（St）为前体，合成糖苷（SGs）。生成了一系列UGT91D2变异体，分别在155位（V155T、V155S和V155A）和134位（Y134F、Y134I和Y134L）进行了氨基酸替代，并通过与野生型（WT）UGT91D2酶的比较，评估其对SG积累的影响。选择这三个替代位点的目的是替换成较小或等效的氨基酸，以增强底物的灵活性。将UGT表达载体导入酵母，并在培养基中添加St以供细胞吸收。两天后，通过LC-MS/MS分析检测了从细胞外排放的SGs（Stv、Reb A、Reb E、Reb D和Reb M）。
如预期的那样，当表达四种甜叶菊UGT时，所有检测到的SGs均积累，而在转化空载体并供给St的酵母中未检测到任何SGs，确认了通过UGT介导的糖基化反应将St转化为SGs（图3）。总体而言，Reb E和Reb D的水平远低于Stv和Reb A，这些反应的底物（图3）。这可能反映了R2侧糖基化活性受限。
图3. 酿酒酵母中UGT介导的甜椒素(St)的糖基化。图中展示了SGs的平均水平及其标准差，基于4-7个生物重复通过LC-MS/MS分析得出。与野生型(WT)对照组的显著性差异使用Student’s t检验进行评估，图表上方标明显著性：**p < 0.01，*p < 0.05，ns表示无显著性。图表排列顺序与图1A一致。UGT91D2介导的转化通过浅灰色箭头连接底物和对应产物的图表。
在UGT91D2中，V155残基位于UDP-Glc的Glc部分附近（图2），被替换为T、S或A。当表达UGT91D2V155T时，Reb E、Reb D和Reb M的水平比野生型控制组显著增加了2.0至2.5倍（图3），这表明V155T替代增强了R2侧的糖基化反应，而这一反应对生产这些SGs是必需的。相比之下，与对照组相比，在UGT91D2V155T表达的酵母中，Stv（一种R1侧糖基化产物）的水平略有下降（图3）。然而，由于R2侧反应的增强使得R1侧反应的准确评估变得困难，因此尚不清楚V155T替代是否对R1侧产生了显著影响。UGT91D2中的V155S和V155A替代导致Reb D水平显著降低，分别下降至0.28倍和0.68倍（图3），表明这些替代物对活性产生了负面影响。
Y134位于UGT91D2的一个腔体中，该腔体容纳SGs，特别是Glc部分的C5′′-CH2OH基团（图2）。该残基被替换为F、I或L。所有测量的SG水平在表达UGT91D2Y134L或UGT91D2Y134I的酵母中显著降低，而表达UGT91D2Y134F对SG水平的影响较小。这表明，将Y134替代为I或L（其侧链较小）对UGT91D2糖基化活性产生了显著的负面影响，特别是在R1侧，并且可能也影响R2侧（图3）。然而，由于先前步骤的抑制，导致SG底物的可用性大大降低，因此很难明确确定对R2侧活性的影响。在后续的部分中，将重点讨论V155T替代，因为它在酵母实验中明显提高了UGT91D2的活性。
3.UGT91D2和UGT91D2V155T在烟草中的活性
使用烟草的瞬时表达系统研究了V155T替代对UGT91D2活性的影响。通过感染的叶片评估了UGT91D2和UGT91D2V155T的底物转化情况。为了对比，还包括了来自甜叶菊的UGT91D1，它是UGT91D2的同源蛋白（氨基酸身份为95%），已报道其对SGs没有活性。将UGT91D基因的全长编码序列克隆到pGWB2载体中，并在菜花花叶病毒（CaMV）35S启动子的控制下进行表达。然后将这些二元载体导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），并用于通过浸润感染叶片。感染后两天，向感染的叶片中添加了1 mM的底物，包括斯图维尔13-O-葡萄糖苷（S13G）、鲁布（Rub）、甜菊苷（Stv）和Reb A。24小时后收集了叶片，并测量了底物和产物的积累。
当S13G被引入叶片组织时，它在R1侧被糖基化，生成Sb。与UGT91D2表达的组织相比，在表达UGT91D2V155T的组织中Sb含量略有显著增加，表明V155T替代增强了酶的R1侧糖基化活性（图4A）。然而需要注意的是，即使在对照组样本中，也观察到了显著的Sb积累（图4A），这可能是由于烟草中内源性酶活性的影响，部分解释了观察到的Sb水平增加幅度有限。
图4. UGT91D1、UGT91D2或UGT91D2V155T在烟草叶片中对SG底物的转化。UGT91D1、UGT91D2或UGT91D2V155T在烟草叶片中瞬时表达，将S13G (A)、Rub (B)、Stv (C)或Reb A (D)转化为其对应的产物。pBI121载体作为对照(C)。UGT91D2介导的转化通过浅灰色箭头连接底物和产物图表。细箭头及虚线表示副反应。误差条表示基于8-12个生物重复的标准差。与对照(C)相比以及UGT91D2和UGT91D2V155T之间的显著性差异使用Student’s t检验评估：**p < 0.01，*p < 0.05，ns表示无显著性。DW表示干重。
对于Rub，R1侧的糖基化将其转化为Stv，随后通过R2侧糖基化转化为Reb E。这导致了Stv和Reb E的积累增加，而Rub的水平在UGT91D2和UGT91D2V155T表达的叶片中分别下降了35%和30%，与对照组相比（图4B）。UGT91D2和UGT91D2V155T之间Stv和Reb E的水平差异相对较小（小于2倍）（图4B），由于转化过程是顺序进行的，这使得这些结果的解读变得复杂。尽管如此，V155T替代对R1侧糖基化活性的增强似乎不如对R2侧活性的增强明显，后续结果（见图4C、D）也支持这一点。从Rub生成Dul A的过程，即在R1侧将Rh而非Glc转移，其产量在UGT91D2V155T中明显减少，与UGT91D2相比（图4B）。这表明，V155T替代减少了Rub转化过程中UDP-糖特异性的不明确性。
UGT91D2和UGT91D2V155T还促进了Stv转化为Reb E，Reb A转化为Reb D的R2侧糖基化反应（图4C、D）。值得注意的是，与UGT91D2相比，UGT91D2V155T的Reb E和Reb D积累分别提高了3.4倍和11.4倍（图4C、D）。此外，UGT91D2还催化了一个副反应，其中Reb A通过R2侧Rh转移转化为Reb J。在UGT91D2V155T中，Reb J的量为UGT91D2的20%（图4D）。这些结果表明，V155T替代增强了R2侧Glc转移活性，同时抑制了Rh向Reb A的非特异性转移。
与R1侧糖基化反应中Rub的减少（图4B）相比，在R2侧反应中，Stv和Reb A的水平与对照组相比没有显著下降（图4C、D）。此外，即使是在高度活跃的UGT91D2V155T的情况下，R2侧反应的产物/底物比总体上仍低于R1侧反应（图4C、D与图4A、B相比）。这些结果支持了R2侧糖基化反应比R1侧更加受限的观点，即使在UGT91D2V155T活性得到改善的情况下，这一趋势依然成立。
在UGT91D1中，观察到Dul A和Reb J的小幅但显著增加，分别通过R1侧和R2侧的Rh转移生成（图4B、D）。UGT91D1中Reb J的水平显著低于UGT91D2，而Dul A的积累在UGT91D1和UGT91D2之间相当。这些观察结果表明，UGT91D1在催化这些较小SG生成的反应中活性较弱（与UGT91D2相比相当或更低）。
为了比较UGT91D蛋白的积累水平，在感染后2天对烟草叶片提取液进行了LC-MS/MS分析，并量化了UGT91D1、UGT91D2和UGT91D2V155T蛋白。量化了三种UGT91D蛋白共同的肽段。结果发现，UGT91D2和UGT91D2V155T的积累水平相似，而UGT91D1的积累水平相对较低，但显著低于UGT91D2蛋白的积累水平。对照样本中未检测到UGT91D蛋白，表明UGT91D蛋白仅在转化的样本中以微量存在。
这些结果表明，V155T替代提高了UGT91D2在烟草中R1侧和R2侧糖基化反应的活性，尤其是对R2侧的影响较为显著。
4.从St在烟草中生成SGs
通过瞬时表达四种来自甜叶菊的UGTs（UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1，以及UGT91D2或UGT91D2V155T）来从其苷元St生成SGs。使用如前所述的二元载体准备并进行根癌农杆菌感染。感染后两天，将St溶液浸润到叶片中，24小时后收获叶片，测量St和SGs的积累。
当三个UGTs（UGT85C2、UGT74G1、UGT76G1，统称为3UGT）被引入时，相较于对照组，Rb（3UGT代谢途径的终产物）和Reb B的水平显著增加，而其他测量的SGs没有显著增加（图5）。相反，S13G、Sb和Stv的水平显著下降（图5）。这些下降可能部分归因于引入的UGTs对烟草叶片中未定义的内源性活性产生了竞争效应。对照组中一些SGs的显著积累，包括这些下降的SGs，支持了这种内源性活性的存在（图5）。
图5. 甜椒素(St)在烟草叶片中形成SGs。展示了St和主要SGs的含量。UGT85C2、UGT74G1和UGT76G1统称为3UGT。误差条表示14或15个生物重复的标准差。与对照(C)相比以及样本之间的显著性差异通过Student’s t检验评估：**p < 0.01，*p < 0.05，ns表示无显著性。图表按图1A中的顺序排列。UGT91D2介导的转化通过浅灰色箭头连接底物和产物图表。DW表示干重。
当UGT91D2或UGT91D2V155T与这三个UGTs共同表达时（即3UGT + UGT91D2和3UGT + UGT91D2V155T），相较于仅表达3UGT时，所有测量的SGs的积累显著增加超过10倍，除了S13G、S19G、Rub（这些反应不需要UGT91D2）和Sb（图5）。相反，相较于3UGT，Rub的水平在3UGT + UGT91D2中下降了48%，在3UGT + UGT91D2V155T中下降了60%，这可能是由于Rub转化为下游SGs的量显著增加（图5）。
依赖于UGT91D2催化S13G在R1侧的糖基化，Sb和Reb B的水平在3UGT + UGT91D2V155T中略有显著增加，较3UGT + UGT91D2略高（图5）。然而，3UGT + UGT91D2V155T和3UGT + UGT91D2之间在Stv和Reb A的水平上未观察到显著差异（图5）。由于Sb、Stv和Reb A进一步转化为其他SGs，因此这些结果需要谨慎解读。然而，它们表明，V155T替代对R1侧糖基化的影响相对较小。
Reb E、Reb D和Reb M的水平，这些生成需要UGT91D2在R2侧的糖基化，分别在3UGT + UGT91D2V155T中比在3UGT + UGT91D2中高8.9倍、8.8倍和12.3倍（图5）。这些结果表明，V155T替代大大增强了R2侧糖基化。然而，尽管这些水平有所增加，Reb E、Reb D和Reb M的水平仍远低于它们的前体，如Stv和Reb A，突显了UGT91D2在R2侧活性的有限性。
UGT91D2与三个UGTs（3UGT + UGT91D2）共同表达时，Dul A、Reb C、Reb F和Reb N的积累增加（图6，见图1B）。然而，当UGT91D2V155T代替UGT91D2表达时，含有非Glc糖的次要SG的增加被显著抑制，这些糖通过β-1,2连接键附着在SG的Glc部分（图6）。相比之下，次要SG Reb I的积累在四种天然UGTs（3UGT + UGT91D2）的表达下有所增加，类似其他次要SGs，而UGT91D2V155T表达（3UGT + UGT91D2V155T）并未减少这一增加（图6）。Reb I仅含有Glc作为糖部分（图1B），并且可能通过β-1,3糖基化从Reb A形成，可能是由UGT76G1而非UGT91D2催化。
图6. UGT介导的在烟草中次要SGs的生产。UGT85C2、UGT74G1和UGT76G1统称为3UGT。次要SGs的类似物在括号中表示。误差条表示基于14或15个生物重复的标准差。与对照相比以及样本之间的显著性差异通过Student’s t检验评估：**p < 0.01，*p < 0.05，ns表示无显著性。
分析感染后2天的烟草叶片提取物，显示UGT91D2及其变体的特异性肽段在各个样本之间没有显著差异。
03
结论
1.UGT91D2的区域特异性
UGT91D2催化SGs在R1和R2两侧的β-1,2糖基化反应，使用UDP-Glc作为糖供体。然而，R2侧的糖基化活性明显低于R1侧。UGT91D2的这种区域特异性主要导致甜叶菊中Stv和Reb A的积累较高，而高度糖基化的SGs（如Reb D和Reb M）的积累较低。这种SG积累模式在酿酒酵母（图3）和烟草（图4B、D）中也有观察到，即使在表达了改进活性的UGT91D2V155T变体时也是如此。这一结果表明，V155T替代仅部分缓解了R2侧糖基化的限制。
通过结构引导工程改造UGT91D2，发现V155T替代显著提高了R2侧的糖基化活性。当表达UGT91D2V155T时，在酿酒酵母（图3）和烟草（图4B、D）中观察到Reb E、Reb D和Reb M水平的显著增加。相比之下，未观察到V155T替代对R1侧糖基化的显著提升。尽管如此，在这些瞬时烟草基因表达实验中，Sb和Reb B的水平略有显著增加（小于1.5倍）（图4A），但未观察到Stv和Reb A的增加（图4B）。尽管如此，糖供体特异性在R1和R2两侧的糖基化反应中有所改善，具体表现在次要SG的积累（下文将讨论）。事实上，V155T替代相关的结构变化似乎显著影响了UDP-糖的识别，但对SG的识别影响较小，这是可以预期的，因为该氨基酸残基的位置。SG在UGT91D2和UGT91D2V155T的模型结构中位置相似，在两者中观察到相同程度的Stv位移。然而，在Rub和Stv结合的UGT91D2V155T结构中，相较于UGT91D2结构，UDP-Glc的Glc部分向催化中心位移了1.4和2.6 Å，分别对应Rub和Stv。这突出了该氨基酸残基在UDP-糖识别中的关键作用。Rub和Stv结合模型中的这些位移也支持了R1和R2侧糖基化反应中糖供体特异性的提高。
为了解释上述看似矛盾的结果，可以合理地认为，V155T替代对R2侧糖基化反应的活性改善比R1侧更为显著，这一点从主要SGs的积累中可以看出。
对UGT91结构的比较显示，Stv（R2侧糖基化的底物）在UGT91D2中相较于Rub（R1侧反应的底物）远离催化中心。而在OsUGT91C1中并未观察到这种位移。这些结果表明，UGT91D2中R1和R2侧糖基化的糖受体定位差异，有助于其区域特异性特征。由于对糖受体的特异性模糊，UGT91D2中与SG识别相关的氨基酸残基通常较为可变且不太保守。事实上，UGT91D2和OsUGT91C1在假定的SG结合区域中的许多氨基酸有所不同（图2）。聚焦于其中的一个氨基酸残基，UGT91D2中的Y134，并进行了替代实验，但这些替代并未改善活性（图3）。为了通过改变底物结合位置来提高R2侧糖基化活性，可能需要进一步修改多个参与底物识别的氨基酸残基。
为了更详细地研究这些问题，使用纯化的重组蛋白进行的体外酶活性测定将是必要的，以定量评估UGT91D2在每一侧的酶活性。最初尝试通过酿酒酵母表达UGT91D2重组蛋白来进行此分析，但由于内源性蛋白酶的严重降解，这些尝试未能成功。此外，使用小麦胚芽细胞-free翻译系统合成的UGT91D2蛋白被发现是无活性的。
2.UGT91D2的糖供体特异性
在烟草中，替代原生UGT91D2的突变体UGT91D2V155T显著抑制了支链产物的积累（图4B、D）。这些产物是通过与UDP-Glc以外的UDP-糖（如UDP-Rh和UDP-Xy）进行β-1,2糖基化反应形成的。副反应产物包括Stv的类似物（Dul A）、Reb A的类似物（Reb C、Reb F）、Reb D的类似物（Reb J）以及Reb M的类似物（Reb N）（图1B）。这些次要SG的进一步减少表明，V155T替代抑制了UDP-糖的模糊识别，从而增强了UGT91D2在R1和R2两侧催化糖基化反应时对UDP-Glc的特异性。这种糖供体特异性的提升支持了V155T依赖的UGT91D2活性增强，尽管这一增强并未在主要SG的积累结果中得到强有力的支持。
为了理解V155T替代如何增强UGT91D2对UDP-Glc的特异性，仔细分析了UGT91D2V155T与底物复合物（UGT91D2V155T:UDP-Glc:Rub和UGT91D2V155T:UDP-Glc:Stv）的模型结构，特别是围绕该残基的区域。在UGT91D2V155T的两个模型中，由于UDP-Glc的Glc部分发生了位移，Glc受体的C2’–OH和Glc供体的C1’’分别与催化中心的H38残基相距2.9和4.0 Å（图7）。值得注意的是，在这两个UGT91D2V155T模型中，UDP-Glc的Glc部分与T155、T156、S376和D397等残基形成了直接或间接的极性相互作用（图7）。
图7. UGT91D2V155T模型结构与底物对接。展示了围绕活性位点的结构，并在相关虚线旁边标出距离（单位：Å）。颜色代码如下：氧（红色）、氮（蓝色）、硫（黄色）、磷（橙色）和催化H38的碳骨架（深灰色）。(A) UGT91D2V155T模型结构与UDP-Glc和Rub对接（UGT91D2V155T:UDP-Glc:Rub）。(B) UGT91D2V155T模型结构与UDP-Glc和Stv对接（UGT91D2V155T:UDP-Glc:Stv）。
特别地，Glc部分的C5′’-CH2OH基团在2.8 Å的距离内与T155侧链中的氧原子形成了氢键（图7）。尽管UGT91D2和UGT91D2V155T中容纳C5′’-CH2OH的腔体大小相当，但UGT91D2V155T中的氢键形成使得C5′’-CH2OH更靠近催化中心。因此，C5′’-CH2OH在UGT91D2V155T和OsUGT91C1中的定位相似。这个极性相互作用是UDP-Glc特有的，因为UDP-Rh和UDP-Xh中相应的C5′’-CH3无法与T155中的羟基形成氢键。这个特异性与UDP-Glc的相互作用，可能是UGT91D2V155T糖供体特异性增强的原因之一。
3.甜叶菊糖苷（SG）生物合成工程的见解
植物的糖基转移酶（UGTs）通常表现出模糊的底物特异性，这一特性也出现在参与SG生物合成的两种糖基转移酶——UGT76G1和UGT91D2上。这些酶能够接受各种SG和UDP-糖作为糖基受体和供体。UGT76G1和UGT91D2都对产生高糖基化和分支的SGs（如Reb D和Reb M）至关重要，而这些SGs因其优良的商业性质而受到重视。因此，这些酶是旨在提升甜叶菊中SG产量的工程策略的关键靶点。已知天然存在的UGT76G1等位基因会影响酶活性，有时会导致甜叶菊植物中某些特定SG的减少或消失。近期，通过结构引导的UGT76G1和UGT91D2工程技术，已开发出具有增强性质的酶变体。
在本研究中展示了对UGT91D2酶进行工程改造的一个例子，特别是通过V155T替代。这一改造增强了酶对糖供体的特异性，有效减少了不必要的副反应，并显著提高了高糖基化SG的产量。这些改造可能涉及使用先进的CRISPR-Cas技术通过碱基编辑和原位编辑在甜叶菊基因组中靶向UGT91D2基因，从而实现精准的DNA修改。值得注意的是，在使用甜叶菊中的UGT进行SG生产时，发现UGT91D2中的V155T替代在植物宿主烟草中对SG积累的影响更为显著（图5），而在酿酒酵母中的影响较小（图3）。这些发现可能表明存在尚未明确的植物特有机制，可以使UGT91D2的改进活性在SG积累中得到更有效的发挥。这突显了靶向编辑的潜力，即用编码V155T变体的UGT91D2替代SG生产甜叶菊植物中的原生UGT91D2等位基因。
此外，在微生物中（如大肠杆菌和酵母）异源生产有价值的SGs，作为一种有吸引力的替代方案，已有多个尝试被报道。UGT91D2的改进变体也可以适应于微生物系统中使用。本研究展示的进展代表了提升下一代甜叶菊甜味剂生物合成的重要一步。
DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c09392
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