卡拉胶是存在于某些红藻细胞壁中的硫酸化多糖，由通过交替的 α-1,3 和 β-1,4 糖苷键连接在一起的半乳糖 (G) 残基主链组成。存在各种类型的卡拉胶，通过硫酸盐取代的位置和程度以及红海藻所特有的 3,6-脱水半乳糖 (DA) 的存在来区分。商业上重要的卡拉胶包括κ-、ι-和λ-卡拉胶。κ-卡拉胶含有DA和半乳糖-4-硫酸盐（G4S），ι-卡拉胶包括2-O硫酸化DA和G4S，而λ-卡拉胶主要由半乳糖-2-硫酸盐和2,6-二硫酸化半乳糖组成。在自然界中，卡拉胶被海洋生物酶降解，海洋生物为此进化出特定的糖基水解酶（GH）和硫酸酯酶。Jiang等人最近对这些酶进行了综述。参与分解卡拉胶主链的酶包括内切卡拉胶酶，其切割内部β-1,4键以产生卡拉胶低聚物，在CAZy数据库中被分类为GH家族GH16（κ-卡拉胶酶）、GH82（主要是ι-卡拉胶酶类）和GH150（λ-卡拉胶蛋白酶类）。攻击β-连接的外切卡拉胶降解酶属于GH家族GH2（β-半乳糖苷酶）和GH167（外切β-卡拉胶酶）。负责水解α-1,3键的酶已从GH127（α-1,3-脱水半乳糖苷酶）和GH129（α-1,3-脱水半乳糖苷酶类）家族中鉴定出来。硫酸酯酶可以去除硫酸酯，改变卡拉胶的功能特性及其对各种GH酶类型的敏感性。根据序列同源性、结构和机制，它们被分为4个家族（SulfoAtlas），其中S1甲酰基甘氨酸依赖性硫酸酯酶家族包括大多数已知的硫酸酯酶。Hettle等人最近对作用于海洋多糖的硫酸酯酶进行了广泛的综述。

迄今为止，只有少数具有卡拉胶活性硫酸酯酶被表征，它们属于S1亚家族7、17、19和81。首次报道的卡拉胶硫酸酯酶是来自Pseudomonas carrageenovora的外切作用κ-卡拉胶硫酸酯酶Psc-κ-Cgs，它可以去除κ-卡拉胶低聚物非还原端的4-O-硫酸酯。随后，鉴定出一种来自大西洋Paraglaciecola atlantica（以前被归类为大西洋假交替单胞菌）的内切4S-ιota卡拉胶硫酸酯酶PaS1_19A，专门用于去除ι-卡拉胶中的内部4-O-硫酸酯。从P. atlantica.中也鉴定出两种内切κ-卡拉胶硫酸酯酶，Q15XH1_S1_7和Q15XG7_S1_19。突出了卡拉胶硫酸酯酶的特异性，已经表明4S-ιota卡拉胶硫酸酶PaS1_19A不会去除κ-卡拉胶中4位的硫酸酯，而Q15XH1_S1_7和Q15XG7_S1_19κ-卡拉胶硫酸酯酶对ι-卡拉胶没有活性。与首次鉴定出的仅作用于低聚物的卡拉胶硫酸酯酶（Psc-κ-Cgs）相比，从P. atlantica.中鉴定出的三种硫酸酯酶也作用于卡拉胶聚合物，突显了S1家族中硫酸酯酶的多样性。参与卡拉胶降解的酶装置已在几种海洋微生物中得到表征，例如Zolbellia galactanivorans 和 Pseudoalteromonas fuliginea PS47,这表明需要几种具有不同底物偏好的硫酸酯酶。

S1硫酸酯酶是钙依赖性的，并且包含一个必需的钙结合位点（通常是D-D-D-Q/N），该位点在所有具有已知3D结构的S1硫酸酯酶中都是保守的。它们需要半胱氨酸或丝氨酸翻译后修饰为甲酰基甘氨酸，这是由甲酰基甘氨酸产生酶催化的。这种修饰是由家族内高度保守的12个氨基酸序列（C/S-X-P/a-X-R-X-X-X-L/X-T/X-G/X-R/X）指导的，从发生修饰的C/S开始。此外，S1硫酸酯酶在对硫酸盐水解至关重要的催化位点上共享一组极性残基。尽管序列分析取得了进展，但由于底物识别中涉及的关键残基数据有限，准确预测底物特异性仍然具有挑战性。

鉴于海藻中普遍存在硫酸化多糖，如琼脂、卡拉胶、岩藻多糖和石莼多糖，许多海洋微生物拥有利用这些生物聚合物所需的代谢机制，从而在海洋碳循环中发挥着至关重要的作用。虽然已经表征了许多对源自海洋微生物和环境的多糖有活性的酶，但关于海洋多糖特异性硫酸酯酶的信息仍然有限。然而，这些酶的重要性是显而易见的，特别是在卡拉胶的工业加工中，靶向去除硫酸根和生产新的卡拉胶结构可以产生新的功能特性和潜在的生物活性。

在这里，我们描述了从北极中海脊（AMOR）收集的宏基因组数据集中鉴定出的耐热卡拉胶硫酸酯酶的鉴定、生产和功能及结构特征。在这个数据集中，以前已经发现了水解褐藻多糖褐藻胶的嗜热酶。深海热液微生物也被描述了硫酸化胞外多糖的产生，因此这些栖息地有望发现新的硫酸酯酶。

这种酶名为AMOR_S1_16A，具有外切作用机制，可以去除κ-卡拉胶低聚物非还原端4位的硫酸酯。AMOR_S1_16A代表S1_16亚家族中第一个被鉴定和结构解析的κ-卡拉胶硫酸酯酶。由于可用结构的数量有限，它为卡拉胶加工的多样化和复杂的酶库引入了一种重要的新功能，同时增强了对S1_16亚家族底物特异性和特征的理解。

为了鉴定新的海藻碳水化合物硫酸酯酶，筛选了AMOR宏基因组中编码碳水化合物活性酶的基因。共有16106个开放阅读框对dbCAN、CAZy或SulfAltas有显著点击（或对每个ORF都有多次点击），其中473个对SulfAtlas有点击。

最初，这项研究的目的是确定新的岩藻多糖作用硫酸酯酶，并根据两者选择 AMOR_S1_16A硫酸酯酶亚家族和基因位置。最近对海藻降解海洋细菌 Verrucomicrobia Lentimonas sp.CC4 的研究表明，S1_16 的数量惊人地高硫酸酯酶存在于其基因组中，S1_16 亚家族被发现很有趣，因为尚未鉴定出该家族中的任何酶对海藻多糖具有活性。 SulfAtlas 的 473 次点击中有 52 次是硫酸酯酶被指定为S1_16亚科。 AMOR_S1_16A 与苔藓菌科的宏基因组组装基因组相连，与编码来自家族的 GH 的基因位于同一重叠群上，其中包含作用于海藻多糖的推定酶。这些家族包括 GH 家族 29、95、109、116、141 和 151，其中岩藻多糖活性酶已从 GH 家族 29 和 95 中鉴定出来。AMOR_S1_16A 蛋白长 485 个氨基酸，包含预测的 23 个氨基酸的 N 端信号肽。 InterProScan 分析揭示了蛋白质序列中几个预测的保守结构域和残基。 N端硫酸酯酶结构域 IPR000917 被预测为从位置 37 到 357，包括保守的硫酸酯酶位点IPR024607，该位点以半胱氨酸开始，半胱氨酸通常被修饰形成甲酰基甘氨酸，见图1。

图1.AMOR_S1_16A的一级结构和预测结构域。编号对应于全长酶序列，鉴定的结构域如下：红色：N-末端信号肽；蓝色：IPR000917 N-末端硫酸酯酶结构域；绿色：IPR024607硫酸酯酶位点。

硫酸酯酶亚家族的归属是基于使用SulfoAtlas的蛋白质BLAST。 AMOR_S1_16A属于硫酸酯酶S1_16亚家族，包括已知的N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐（6S-GalNAc）和G4S/4S-GalNAb活性。AMOR_S1_16A与从南大西洋富硫热液沉积物中收集的宏基因组数据集中鉴定的S1_16亚家族DUF4976结构域蛋白具有最高的序列同一性（68%）。与GenBank、SulfoAtlas和PDB中可用蛋白质序列的序列比对表明，具有已知结构的最相似蛋白质（46%序列同一性）是来自Hungatela hathewayi的HhSulfo_S1_S16肠道微生物6S-GalNAc硫酸酯酶（PDB:6UST），而AMOR_S1_16A与BT3769_S1_16（PDB:7OZA）具有35.6%的序列同一度，与来自拟杆菌属thetaiotaomitron的BT3057_S1_16的G4S/4S GalNAc硫酸酶具有31%的序列同同一性。亚群I和II主要存在于细菌中，并且是相互排斥的，尽管细菌和变形菌基因组可能具有来自亚群I或II的基因。尽管不常见，但一些GH128编码基因存在于细菌中预测的多糖利用位点中，并且经常与来自GH16_3亚家族的β-1,3-葡聚糖酶一起观察到，这表明这种多糖利用基因座对β-1,3-葡聚糖具有特异性。

根据Luis等人的研究，S1_16亚家族中的大多数序列都来自海洋环境。然而，尽管G4S和G6S在海洋多糖中普遍存在，但尚未发现该亚家族的海洋硫酸酯酶。

已知的卡拉胶活性硫酸酯酶属于S1亚家族7、17、19和81。AMOR_S1_16A 的 MSA 已知卡拉胶 硫酸酯酶与外切 G4S PfS1_19B 显示出最高的序列同一性 (34%)硫酸酯酶来自P. fuliginea MSA 已确定硫酸酯酶揭示了 S1 特有的保守氨基酸残基的存在硫酸酯酶。硫酸酯酶特征基序（在AMOR_S1_16A:58CSPTRASILTGK69中）存在于比对中使用的所有硫酸酯酶序列中，并含有翻译后修饰为甲酰基甘氨酸的半胱氨酸，但BT3057_S1_16和BT3769_S1_16除外，它们含有丝氨酸，通常存在于兼性或严格厌氧原核生物的硫酸酯酶中。参与金属配位的氨基酸存在于所有硫酸酯酶中（在AMOR_S1_16A:D18-D19-D263-N264中），并且对于所有比较的硫酸酯酶来说都是相似的，除了两种S1_7硫酸酯酶，其中天冬酰胺被组氨酸取代，这在某些情况下可见。S1_16硫酸酯酶的保守色氨酸（AMOR_S1_16A中的W79）存在于S1_16序列中，所有S1硫酸酯酶都有两个极性残基Lys和His（AMOR_S181A中的K287和H201）参与底物识别（补充图S1）。

编码 AMOR_S1_16A 的基因针对在大肠杆菌中表达进行了密码子优化，并重组生产和纯化，带有 C 端 His 6标签，不含预测的 N 端信号肽。硫酸酯酶使用模型底物 pNCS 验证活性。

2.最佳反应参数

在 40 分钟反应中，AMOR_S1_16A 在 60 °C 时表现出最高活性，而该最大活性的 19% 在 25 °C 下保持，10% 在 90 °C 下保持（图 2 A）。60°C的最佳反应温度远高于其他卡拉胶硫酸酯酶的测定温度，例如，来自大西洋Paraglaciecola atlantica PaS1_19A的内切4S-ιota卡拉胶酶为34°C，两种内切κ-卡拉胶硫酸酯酶Q15XH1_S1_7和Q15XG7_S1_19为25°C。

图2.AMOR_S1_16A的活性特征。A：温度、B：pH、C:NaCl和D：离子对相对酶活性的影响。图E显示了AMOR_S1_16A在60°C下预温育不同时间后的剩余活性。所有反应混合物均使用1μM AMOR_S1_16A和2.5 mM pNCS制备，反应40分钟后测量反应产物。实验进行了三次，结果显示为平均值±标准差。对于产品水平最高的情况，活性标准化为100%。对于阳离子的影响，对于不添加离子的反应，活性被归一化为100%。

AMOR_S1_16A的最高最佳反应温度与酶的来源非常吻合，因为该序列是从位于约70°C海水中的腔室中收集的海洋基因组中获得的。来自同一来源的PL7家族（Genbank登录号MH727998）和PL17家族（Genbank登录号MT444120）的两种褐藻胶裂解酶的最佳反应温度分别为65°C（反应50分钟）和90°C（5分钟）。一种新鉴定的κ-卡拉胶酶也显示出耐热性，能够耐受高达100°C的反应温度。在60°C下，在3.6-9.0的范围内测试了pH值对酶活性的影响。AMOR_S1_16A在较宽的pH范围内具有活性，在pH 5.6左右对pNCS的活性最高（图2B），与其他卡拉胶硫酸酯酶报告的pH最佳值相比略低。然而，AMOR_S1_16A在pH值4.6-7.5范围内保持了80%以上的最大活性（图2B）。AMOR_S1_16A也被证明在0至2000 mM NaCl的宽盐度范围内具有活性，在约400 mM NaCl时活性最高，接近海水的NaCl浓度（图2C）。

在60°C下，使用10 mM的MnCl2、NiCl2、ZnCl2、CaCl2、CuCl2或MgCl2在25 mM NaOAc、pH 5.6、400 mM NaCl中测定二价离子的影响。测试不同二价离子的实验表明，Ca2+和Mg2+的存在都会诱导活性，而Mn2+、Ni2+和Cu2+会抑制AMOR_S1_16A的活性（图2D）。与未添加离子的反应相比，钙离子的存在诱导了430%的活性（图2D）。AMOR_S1_16A的钙依赖性与S1硫酸酯酶含有钙结合位点的事实非常吻合。

AMOR_S1_16A的热稳定性是通过在60°C下无底物的酶预孵育0-24小时后，测量标准反应中的硫酸酯酶活性来评估的（图2E）。AMOR_S1_16A在60°C下孵育约5小时后保持高活性。更长的孵育时间导致活性明显降低，孵育12小时后几乎没有活性残留（图2E）。在不同温度下孵育酶16小时的进一步实验表明，酶在50°C下是稳定的，但在70°C下失去了所有活性（数据未显示）。相比之下，来自海洋细菌Microbulbifer thermolerans的耐热κ-卡拉胶酶在100°C下孵育60分钟后保留了约50%的活性，而来自Pseudoalteromonas sp.的耐热岩藻多糖硫酸酯酶在68°C的最佳反应温度下孵育12小时后保留了近60%的最大活性。据我们所知，之前没有描述过耐热的κ-卡拉胶硫酸酯酶。

3.寡糖底物的生产

为了生产用于酶活性测试的各种不同底物，使用TFA（60°C下1 M TFA 1小时）对天然全长商业底物进行部分水解，从而产生低聚物。κ-卡拉胶寡聚物是通过用来自Z. galactanivorans的κ-卡拉胶酶ZgCgk16A水解天然全长κ-卡拉胶而额外产生的（EC号3.2.1.83），该酶专门水解β-1,4键，产生非还原端为DA、还原端为G4S的寡糖。通过SEC-RI和MALDI-TOF质谱（MS）验证了寡糖的生产（仅显示和讨论了κ-卡拉胶）。使用SEC-RI，天然κ-卡拉胶的分子量估计约为800 kDa（补充图S3和S4）。经TFA处理后，分子量降至6kDa以下（补充图S3）。用ZgCgk16A处理天然全长κ-卡拉胶后，观察到类似的尺寸减小（补充图S3）。由于卡拉胶是一种带电化合物，它在溶液中会表现出棒状行为。此外，由于抗衡离子，流体动力学半径将更大，导致与普鲁兰标准相比分子量明显更高。然而，当将聚合物与低聚物进行比较时，使用SEC-RI验证了全长天然底物的明显降解。

负离子模式下的MALDI-TOF质谱分析证实，κ-卡拉胶水解成不同聚合度（DP）和硫酸化程度的硫酸化寡糖混合物。在κ-卡拉胶的酶解产物中检测到的最丰富的寡糖是四聚体κ-新卡拉胶四糖，其次是较短的单位（DP3、DP2和G4S）。检测到的DP16约为3kDa的较大寡糖含量较低（补充表S2）。我们将κ-新卡拉胶四糖鉴定为κ-卡拉胶酶解物的主要成分，这与ZgCgk16A的表征研究一致，表明κ-卡拉胶四糖是该酶形成的主要终产物。与酶水解产物相比，TFA水解κ-卡拉胶的分析显示，产物的混合物更加异质，寡糖的丰度更高，DP为奇数（DP5、DP7、DP9、DP11、DP13、DP15）。有趣的是，这些寡糖中的大多数在非还原端和还原端都有一个G4S单元。这可以用酸性条件下还原端DA单元的不稳定性来解释，这意味着DA单元将丢失，寡糖将在还原端用G4S缩短一个单位。这也意味着只有奇数寡糖在非还原端具有G4S。κ-卡拉胶的温和酸水解也有类似的结果。

之前使用MALDI-TOF质谱的研究表明，卡拉胶寡糖的电离效率随着分子量的增加而下降，这表明较大的片段可能未被检测到。

脱水产物和亚硫酸盐基团的损失（转化为硫酸盐基团的功能损失）是硫酸化寡糖MALDI-TOF分析过程中发生的常见反应。在我们的分析中检测到这种源内底物修饰，并支持酶水解产物中注释的分配（补充表S2）。然而，在TFA或硫酸酯酶处理引起的脱硫反应之间，或在MALDI-TOF分析过程中，缺乏区分能力，这是应用该技术分析TFA水解κ-卡拉胶中硫酸酯酶活性的主要挑战。因此，我们转向HPAEC作为筛选方法，监测与AMOR_S1_16A孵育后受试底物中硫酸根离子的释放。

4.底物特异性

为了进一步确定AT1/GS3如何调节作物的耐碱性，通过免疫沉淀结合质谱（IP-MS）检测了SbAT1相互作用蛋白。谷胱甘肽S-转移酶(GST)-SbAT1被用于结合碱性处理的根样本中的蛋白质，然后释放这些结合的蛋白质进行进一步分析。检测到386种与SbAT1相互作用的候选蛋白，包括鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基（Gβ亚基）（图4A），这支持了IP-MS的结果，因为众所周知，Gβ和Gγ在一个复合体中共同作用，调节广泛的生物过程。在相互作用的蛋白质中发现了许多水通道蛋白，特别是PIP2;1/2;2和PIP13/14蛋白。据报道，这些水通道蛋白的同源物通过调节植物和哺乳动物的ROS稳态参与胁迫生物学。我们通过进行不同的检测证实了这些蛋白质与SbAT1和SbAT1的相互作用。萤光素酶互补成像（LCI）测定数据以及共免疫沉淀（Co-IP）测定和下拉测定都证明了它们在体内和体外的相互作用（图4，A和B）。

为了确定AMOR_S1_16A的底物特异性，使用天然聚合物底物、低聚物和单体进行活性测定。使用HPAEC检测水解硫酸根离子，结果表明AMOR_S1_16A对TFA水解的κ-卡拉胶具有硫酸酯酶活性（补充图S5），而在与天然聚合物κ-卡拉胶或商业完整和TFA水解琼脂、ι-卡拉胶、λ-卡拉胶或本研究中测试的任何岩藻多糖底物的反应中均未检测到硫酸盐释放。这些结果表明，AMOR_S1_16A是一种作用于κ-卡拉胶低聚物的4-O硫酸酯酶。

与κ-卡拉胶一样，ι-卡拉胶也含有G4S，但在ι-卡拉胶中，G4S位于两个硫酸化DA单元之间，而在κ-卡拉胶胶中，G4位于两个中性DA单元之间。这，即具有或不具有硫酸盐取代的邻近糖的性质，可以解释为什么AMOR_S1_16A仅对κ-卡拉胶有活性。对来自P.atlantica的两种κ-卡拉胶硫酸酯酶Q15XH1_S1_7和Q15XG7_S1_19的底物特异性分析表明，这些酶也只作用于κ-卡拉胶，而不作用于ι-卡拉胶。

有趣的是，AMOR_S1_16A在与κ-卡拉胶酶ZgCgk16A反应产生的κ-卡拉胶低聚物反应中没有显示硫酸盐释放。这一发现很有趣，因为目前的卡拉胶分解代谢途径模型表明，硫酸酯酶在卡拉胶酶之后起作用。κ-卡拉胶由G4S和DA的重复单元组成，它们通过交替的α-和β-键结合在一起。卡拉胶酶，如ZgCgk16A，靶向G4S和DA之间的内部β键，产生κ-卡拉胶低聚物，非还原端有DA，还原端有α连接的G4S。酸水解不像酶水解那样受到控制，因此预计产物将是低聚物与非还原端和还原端不同糖的混合物。这与MALDI-TOF数据一致，该数据还显示，在非还原端具有G4S的奇数低聚物的丰度更高，这可能是由于DA在酸中的不稳定性。考虑到化学和酶途径产生不同的低聚物，人们猜测了末端糖残基的重要性，并通过核磁共振波谱进一步研究了这一点。

AMOR_S1_16A属于一个亚家族，据报道对G4S和G6S具有活性。测试了AMOR_S1_16A对商业G6S的活性，但未观察到硫酸盐释放（数据未显示）。据报道，对卡拉胶有活性的4-O硫酸酯酶属于S1亚家族7、17、19和81。来自人类肠道细菌B.thetaiotaomicron的两种S1_16硫酸酯酶BT3057和BT3796对结肠粘蛋白的G4S和4S-GalNAc有活性，而对卡拉胶没有活性。因此，额外测试了AMOR_S1_16A对G4S和4S-GalNAc单糖的活性。虽然G4S底物观察到一些硫酸盐释放，但当AMOR_S1_16A与4S-GalNAc反应时没有观察到硫酸盐释放（结果未显示）。据我们所知，这是首次证明细菌硫酸酯酶对κ-卡拉胶的G4S具有活性。因此，AMOR_S1_16A代表S1_16亚家族中的一种新活性，即κ-卡拉胶低聚物。

应该指出的是，在AMOR_S1_16A来源的连续体上发现的GHs包括，除其他外，推测的岩藻糖苷酶和半乳糖苷酶，它们可能在加工岩藻多糖等海藻多糖中发挥作用。考虑到AMOR_S1_16A的活性，令人感兴趣的是，推测参与卡拉胶代谢的酶缺乏。可以想象，AMOR_S1_16A还有其他底物有待发现，例如本研究中未测试的某些岩藻多糖类型，或者同一连续体上的GH具有迄今为止未知的与卡拉胶代谢相关的活性。

5.作用方式

作用方式使用核磁共振波谱评估AMOR_S1_16A的活性，以进一步了解酶靶向的特定硫酸根，并区分内切性和外切性作用方式。使用2D NMR光谱，完成了用AMOR_S1_16A处理前后TFA水解κ-卡拉胶的完整归属。核磁共振分析显示，κ-卡拉胶低聚物在非还原端有G4S残基，与MALDI-TOF质谱数据和关于κ-卡拉胶酸水解的文献一致。用AMOR_S1_16A处理后，与G4S非还原末端残基（G4SNRE）相关的信号消失，被非还原末端的非硫酸半乳糖（GNRE）所取代，而内部G4S信号（G4S）和与还原末端相关的信号（G4SRE）仍然存在。实时监测反应时，非还原端G4S（G4SNRE-4和G4SNRE-5）的H-4（4.68 ppm）和H-5（3.85 ppm）质子减少，而非硫酸化半乳糖非还原端残基（GNRE）的H-5（3.93 ppm）增加（图3A-C）。这提供了证据表明AMOR_S1_16A具有外显作用模式，仅对κ-卡拉胶低聚物的非还原性末端残基进行脱硫。此外，使用HPAEC检测释放的硫酸根离子，结果表明，1 mg/mLκ-卡拉胶水解物释放了0.04 mg/mL的硫酸盐。κ-卡拉胶的硫酸盐含量约为25%（w/w），相当于0.25mg/mL的硫酸盐。理论上，随机酸水解将导致寡糖中只有50%在非还原端具有硫酸根。如果我们使用这些寡糖的平均DP为5，非还原端有33%的硫酸盐，我们可以估计酶的最大硫酸盐释放量为0.25 mg/mL×0.5×0.33=0.04 mg/mL。这表明酶在非还原端完全脱硫了G4S。AMOR_S1_16A只能对κ-卡拉胶的非还原性末端残基进行脱硫，这一事实可以解释为什么AMOR_S1_1 6A不会从κ-卡拉胶酶ZgCgk16A产生的κ-卡拉胶低聚物中释放硫酸盐。如上所述，卡拉胶酶特异性切割卡拉胶主链中G4S和DA之间的内部β-键，将DA-G4S留在非还原端。如NMR和MALDI-TOF质谱所示，TFA水解的κ-卡拉胶含有低聚物，非还原端有G4S。为了通过酶法生产具有非还原性末端G4S的低聚物，需要脱水半乳糖苷酶的作用来破坏DA和G4S之间的α-键。已经描述了一些卡拉胶α-半乳糖苷酶，但据我们所知，所描述的酶在脱硫的卡拉胶底物上反应。因此，针对 Z. galactanivorans和 Pseudoalteromonas carrageenovora描述的卡拉胶降解途径可能并不适用于所有海洋细菌和/或一些酶功能尚未发现，其中卡拉胶酶首先开始降解，然后是硫酸酯酶，然后是α-半乳糖苷酶。Pseudoalteromonas haloplanktis的情况确实如此，最近的一项发现表明，硫酸酯酶会启动卡拉胶的分解代谢，随后卡拉胶酶会发挥作用。

图3.NMR光谱显示，在AMOR_S1_16A的存在下，Gal4SNRE在TFA水解的κ-卡拉胶中完全脱硫。（A） HSQC光谱叠加显示κ-卡拉胶脱硫。未处理底物的光谱（蓝色/绿色）与与10μM AMOR_S1_16A（红色/粉色）反应后记录的光谱相比，显示G4S残基在非还原端（注释峰）脱硫。HSQC光谱中的相关性表明直接结合的质子和碳的化学位移。（B，C）1H监测的时间分辨光谱显示G4S非还原性末端信号减少（H-4:4.68 ppm和H-5:3.85 ppm），G非还原性终点信号增加（H-4:3.93 ppm）。反应混合物由10 mg/mLκ-卡拉胶（TFA水解）在10 mM NaOAc、200 mM NaCl、10 mM CaCl2、pH 5.6、99.9%D2O和32μM AMOR_S1_16A中组成。G4S:β-d-吡喃半乳糖4-硫酸盐，G:β-d-吡喃半乳糖，NRE:非还原性末端。数字（1-5）表示每个残基中的质子/碳位置。

产生AMOR_S1_16A正确底物的半乳糖苷酶可能存在于与AMOR_S1_1 6A位于同一重叠群上的一些基因中，但这只是猜测，应该通过实验进行测试。然而，这超出了本研究的范围。

6.AMOR_S1_16A的晶体结构

为了深入了解AMOR_S1_16A活性和指导底物特异性的残基的分子基础，我们使用Alphafold2预测的模型作为起点，通过分子置换以3.1Å的分辨率确定了AMOR_S1_1 6A的X射线晶体结构。整体结构具有经典的S1硫酸酯酶3D排列，由N端α/β/α折叠和一个小的C端亚结构域组成（图4A），活性位点位于中心口袋（图4B），该口袋的一侧被保守的色氨酸残基（Trp79）阻断（图4C，D）。这种色氨酸的平面起着一种屏障的作用，可能堆叠在S0位点结合的单元的糖平面上，S0位点是容纳硫酸化残基碳水化合物部分的区域（亚位点命名见Hettle等人（图4C，D）。这种色氨酸已被证明对BT3796_16和BT3057_S1_16（7OZA，7OZ9）中的4-O特异性/活性至关重要。

图4.AMOR_S1_16A的晶体结构表示。（A） 全球卡通形象的整体呈现；N端α/β/α折叠的结构元件分别为红色（b链）、青色（a螺旋）和品红色（环/连接区），存在于所有S1硫酸酯酶中的C端结构域为蓝色。标记催化相关Ca2+离子和半胱氨酸的位置，以及捕获在活性位点口袋中的甘油和形成活性位点口袋壁的色氨酸（W79）。（B） 活性位点口袋的表面概览，包埋甘油，末端阻断色氨酸（W79）。（C，D）k-卡拉胶四糖与活性位点的对接证明了色氨酸的存在会阻断非还原端的口袋，这种空间位阻导致AMOR_S1_16A中没有−S1亚结合位点。

κ-卡拉胶四糖与AMOR_S1_16A活性位点的分子对接表明，Trp79的存在阻断了非还原端的口袋，这种空间位阻导致AMOR_S1_1 6A中没有−S1亚结合位点（图4C，D）。因此，活性位点口袋与AMOR_S1_16A在非还原端对G4S具有活性相容，只为S0和S+1结合位点留出空间。这与其他κ-卡拉胶活性4-O硫酸酯酶形成鲜明对比：例如，PfS1_19b外显硫酸酯酶与κ-卡拉菜胶非还原端的二糖相互作用；因此S-亚位点不在末端残基上。相反，0-亚位点是在距离非还原端一个残基处发现的。

AMOR_S1_16A的活性位点揭示了Ca2+离子的存在，该离子在迄今为止所有已知的具有3D结构的S1硫酸酯酶中都是保守的（图5）。参与Ca2+配位的严格保守残基是Asp18、Asp19、Asp263和Asn264（图5）。AMOR_S1_16A的晶体结构显示没有催化亲核试剂甲酰基甘氨酸残基的证据，而是未改性的Cys58（图5）。AMOR_S1_16A是在没有甲酰甘氨酸生成酶共表达的情况下产生的，大肠杆菌中存在的硫酸酯酶成熟系统似乎能够修饰足够的半胱氨酸以获得活性，但不足以在晶体结构中看到。已经观察到几种S1硫酸酯酶晶体结构，例如ι-卡拉胶硫酸酯酶PsS1_19A（PDB:6BIA）和岩藻多糖活性硫酸酯酶PsFucS1（PDB:7AJ0）。

图5.AMOR_S1_16A活动位点的带状表示。标记位于AMOR_S1_16A活性位点的配位溶剂分子甘油和Ca2+离子的残基。

活性位点结合冷冻保护剂中的甘油分子，涉及氨基酸Lys287、His201、Glu270、Gln370和Asn369（图5）。虽然前两个残基（Lys287和His201）属于在所有S1硫酸酯酶中保守的极性残基，并参与结合被切割的硫酸酯，但Glu270、Asn369和Gln370被定位为识别携带硫酸酯的S0结合位点处的糖单元。这些残基不太保守，并且在已确定结构的不同S1_16酶之间有所不同。

H.hathewayi的AMOR_S1_16A和6S GalNAc硫酸酯酶的结构比较（6UST；图6A）和B.thetaiotaomicron的4S Gal/GalNAc硫酸酯酶BT3796_16（7OZA；图6B）和BT3057-S1_16（7OZ9；图6C）表明，AMOR_S1_16A与少数S1_16已解结构高度相似（Cα叠加的rmsd值见补充表S4）。除了阻断活性位点口袋的Trp（AMOR_S1_16A中的Trp79）外，AMOR_S1_1 6中与S0结合的底物糖单元附近的两个组氨酸残基His125和His149也是S1_16硫酸酯酶的特征（图6D）。主要差异集中在C端和靠近活性位点口袋的特定环路（AMOR_S1_16A中的266-276）。不幸的是，我们未能获得与κ-卡拉胶复合的晶体，但Glu270、Asn369和Gln370似乎位于必须结合在S0亚位点的G4S糖单元的O2位置附近，没有留下乙酰基的空间（图6D）。这与7OZA和7OZ9中的情况形成鲜明对比，其中His423和Arg424（7OZ9）和Trp431（7OZA）允许存在GalNAc单位（图6D）。最接近的6UST在这些位置具有相同的残基构型（图6D），但Glu在6UST中的定位与AMOR_S1_16A不同。AMOR_S1_16A中的Arg273似乎对确定AMOR_S1_1 6A中阳性亚结合位点+S1的特异性很重要（图6D，补充图S8）。

图6.S1_16硫酸酯酶晶体结构的结构比较。AMOR_S1_16的晶体结构整体叠加的卡通表示，颜色为绿色，带有（A）6UST，颜色为黄色，（B）7OZA，颜色为灰色，以及（C）7OZ9，颜色为淡蓝色，突出了核心结构的相似性，而配体结合位点周围的环区域则变化更大。在所有三个面板中，黑色箭头表示活性位点口袋中的配体位置。相应的配体被绘制成棒状。这些配体被放大并叠加在面板5D中。（D） 放大覆盖3D晶体结构中存在的不同配体的活性位点口袋。颜色与面板A-C中的颜色相同。面板D中的方向相对于面板A-C中的方向顺时针旋转180°。所有四种结构的严格保守残基，即Trp79、His125、His149、His201和Ca2+，在AMOR_S1_16中仅以绿色标记，而靠近S0和+S1结合位点的发散残基则以各自的颜色标记，如图A-C所示。

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结论

DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c09751