2024年6月13日，来自加州大学的Collin R. Barnum等人在《Nature Food》上发表了一篇名为Engineered plants provide a photosynthetic platform for the production of diverse human milk oligosaccharides的研究性论文
Abstract
母乳寡糖（HMO）是一类支持婴儿健康和发育的碳水化合物。HMO的巨大健康益处使其成为微生物生产的商业目标；然而，大规模生产约200种结构多样的HMO已被证明是困难的。在这里，我们通过利用植物强大的碳水化合物合成代谢来生产各种HMO。这种多样性包括高价值和复杂的HMO，如乳-N-岩藻五糖I。转基因植物中产生的HMO具有很强的双歧杆菌特性，表明它们有能力作为益生元补充剂，在成人和婴儿健康中具有潜在的应用。技术经济分析表明，在植物中生产HMO为以比微生物生产平台更低的价格大规模生产特定HMO提供了一条途径。我们的工作展示了利用植物实现HMO低成本和可持续生产的前景。
01
简介
母乳是一种完整而全面的食物，旨在滋养和保护婴儿。母乳独特生物活性的一个关键组成部分是母乳寡糖（HMO）的广泛多样性，这些寡糖在建立婴儿的新生肠道微生物群以预防疾病和确保健康发育方面有很好的记录。虽然75%的婴儿在出生后的前6个月内补充或仅喂养婴儿配方奶粉，但目前的婴儿配方奶粉要么不含HMO，要么只含有母乳中约200种HMO中的一到两种，这限制了配方奶粉喂养婴儿的健康结果。除了用于婴儿健康外，HMO还被研究作为益生元在成人健康中的有益作用，以改善肠道屏障功能、降低胃肠道炎症和治疗肠易激性疾病；然而，对成人HMO益处的研究仅限于HMO的一小部分。目前，商业HMO生产依赖于微生物发酵，但迄今为止，微生物发酵只能以适合补充食品的规模商业生产母乳中约200种HMO中的两到五种简单HMO。虽然五种简单的HMO占母乳中HMO质量的很大一部分，但具有一系列连接和聚合度的不同HMO能够促进有益肠道微生物的生长，这些微生物对特定的HMO有偏好。因此，有必要开发生物平台，以生产母乳中发现的更广泛多样的HMO，从而为婴儿和成人补充食品。
糖苷键、核苷酸糖供体和寡糖受体分子的组合性质使母乳中发现的HMO具有很大的多样性。HMO由五种不同的糖组成，D-葡萄糖（Glc）、D-半乳糖（Gal）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）、L-岩藻糖（Fuc）和N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）——通过各种糖苷键连接，产生各种分子结构（图1a）。HMO的生物合成始于乳糖的产生，乳糖可以用岩藻糖或Neu5Ac修饰，形成各种三糖和四糖。乳糖也可以通过糖基转移酶通过添加GlcNAc-β-1,3或GlcNAc-β-1,4来扩展，形成无支链HMO。通过添加GlcNAc-β-1,6，糖基转移酶可以进一步扩展无支链的HMO，以产生有支链HMO（图1b）。GlcNAc可以随后添加Gal-β-1,3或Gal-β-1,4，分别形成I型和II型HMO（图1b）。虽然HMO可以由所有五种单糖组成，但根据其组成，它们通常分为三大HMO组：（1）中性HMO含有Glc、Gal和GlcNAc，（2）岩藻糖基化HMO含有一个中性核心，其中添加了一种或多种Fuc，（3）酸性HMO含有中性核，其中添加了一个或多种Neu5Ac。由于HMO生物合成中需要大量的核苷酸糖和糖基化潜力，合适的宿主必须具有强大的糖代谢能力，能够管理HMO生产的代谢负担。
图1. 植物中三种HMO类别的生产。a. HMO由Glc、Gal、Fuc、GlcNAc和/或Neu5Ac组成，通过Gal-β-1,3/4、GlcNAc-β-1,3/6、Fuc-α-1,2/3/4或Neu5Ac-α-2,3/6糖苷键连接。b. HMO可分为分支、非分支、I型和/或II型HMO。c. 本研究中用于植物HMO生产的HMO生物合成途径。d. 提取离子色谱图（EIC）显示了使用LC-MS/MS在单个植物叶片提取物中鉴定2′FL、3′SL、6′SL、LNFPI、LSTa、LSTc和LNT/LNnT。红色、蓝色和紫色分别表示岩藻糖基化、中性和酸性HMO。由于没有可用标准的较大寡糖的源内裂解，出现了一些进一步的峰值。
与商业发酵中使用的许多微生物不同，植物已经进化出各种聚糖，其中包括来自光合作用固定的二氧化碳的多种核苷。作为糖合成代谢的大师，植物能够产生大量复杂寡糖和多糖。这导致了从植物生物质生产益生元寡糖的商业化运营，如β-葡聚糖、低聚木糖、菊粉或大豆寡糖。这些产品中的许多可以纯化或直接作为食物食用，提供了一种简单的摄入方式。此外，植物可以在开阔的田地里生长，只需要最少的投入，限制了对昂贵基质和无菌条件的需求。植物强大的糖代谢和在农业规模上生长的能力使植物成为大规模生产HMO的理想平台。
由于植物作为碳水化合物生产平台的独特优势，我们测试了它们在烟草中瞬时和稳定表达产生一系列HMO的能力。在这里，我们报告了中性、岩藻糖基化和酸性HMO的工厂内生产，展示了基于植物的生产平台的内在优势。此外，我们发现植物产生的HMO提供了关键双歧杆菌的选择性生长，表明了它们潜在的益生元功效。最后，我们评估了与当前微生物平台相比，在植物中生产HMO的经济可行性。
02
结果
植物中三种HMO类别的生产
HMO的生产需要能够产生特定糖苷键的糖基转移酶的表达。虽然人类HMO的生物合成是通过一种基本未知的途径在高尔基体中进行的，但各种微生物酶能够在细胞质中产生HMO。为了在植物中产生HMO，我们将细菌HMO生物合成酶定位到细胞质中，以产生中性、岩藻糖基化和酸性HMO（图1c）。我们通过在N.benthamiana中的瞬时表达来测试这些途径。瞬时表达允许通过将根癌农杆菌菌株注入植物叶片，使农杆菌能够将HMO生物合成基因插入植物细胞，从而对植物中的生物合成途径进行相对高通量的筛选。在通过质谱（MS）进行表征之前，对瞬时表达HMO生物合成途径的叶子进行液-液萃取、C18固相萃取（SPE）和多孔石墨碳（PGC）SPE。
中性HMO充当其他更复杂HMO（岩藻糖基化和酸性）的核心支架；因此，我们首先靶向I型和II型中性HMO核心结构，即乳-N-四糖（LNT）和乳-N-新四糖（LNnT）。使用两种β-1,4-半乳糖基转移酶（GalTPM1141，Hp0826）、一种β-1,3-半乳糖基转让酶（Cvß3GalT）和一种β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶类（NmLgtA）表达中性HMO生物合成途径，导致乳糖和各种聚合度为3至7的中性HMO的产生。值得注意的是，短暂表达该途径的N.benthamiana产生了四糖LNT（m/z 708.2559）和LNnT（m/z 708.2559), 分别代表母乳中的主要I型和II型HMO（图1d）。此外，我们使用串联质谱（MS/MS）裂解来确定己糖和HexNAc糖的数量，从而确定不同聚合度的较大中性寡糖的生产。这包括五糖和七糖的几种中性异构体。我们的研究结果表明，植物有能力生产以前无法获得的不同聚合度的寡糖，这可能会扩大HMO的功能生物活性。
在成功产生I型和II型中性HMO后，我们研究了植物用岩藻糖修饰中性HMO的能力，因为岩藻糖基化HMO是母乳中含量最丰富的HMO。我们在中性HMO生物合成途径旁瞬时表达了α-1,2-岩藻糖基转移酶(Te2FT)，以产生母乳中最丰富的岩藻糖基化HMO：2′-岩藻糖乳糖（2′FL)(m/z 489.1819)和乳-N-岩藻五糖I(LNFPI)(m/z854.3136)(图1d)。此外，通过m/z和MS/MS裂解鉴定出几种岩藻糖基化六糖异构体。虽然每种异构体的结构尚无法确定，但每种都由四种己糖、一种HexNAc和一种脱氧己糖组成，这表明LNFPI可以进一步用己糖修饰，或者五糖中性HMO可以用额外的岩藻糖修饰。
虽然中性和岩藻糖基化HMO代表母乳中的大多数HMO，但酸性HMO是哺乳动物乳汁中发现的最后一类主要HMO，由于N-乙酰神经氨酸的存在，它们具有独特的生物活性。植物本身不会产生用于生产酸性HMO的供体分子CMP-Neu5Ac。为了生产酸性HMO，我们同时表达了中性HMO生物合成途径、唾液酸转移酶和哺乳动物生产CMP-Neu5Ac的途径。α-2,6-唾液酸转移酶（St6）与中性HMO生物合成途径一起表达，产生酸性三糖6′-唾液酸乳糖（6′SL）（m/z 634.2191), II型酸性HMO，唾液酸内酯-N-新四糖c（LSTc）（m/z 999.3505）（图1d）。α-2,3-糖基转移酶（PmST3）通过中性HMO生物合成途径表达，产生了无数酸性HMO，如酸性三糖3′-唾液酸乳糖（3′SL）（m/z 634.2187）和酸性五糖LSTd（m/z 999.3510）（图1d）。除了在体内制造几种LST异构体外，还使用m/z和MS/MS裂解鉴定了六种酸性六糖异构体。每种异构体由四种己糖、一种HexNAc和一种Neu5Ac组成。这些结果共同表明，植物能够组合或同时产生所有三类HMO，包括I型和II型结构，标志着单个异源生物体中HMO的最大多样性。
复杂岩藻糖基HMO的优化生产
微生物生产平台无法大规模生产聚合度更高的HMO，导致许多更大、更复杂的HMO研究不足。LNFPI是一种岩藻糖基化五糖，是第二丰富的岩藻糖基化HMO。尽管LNFPI在母乳中含量很高，但它仍然难以在微生物中发酵生产，限制了研究其潜在健康益处的努力。因此，我们试图通过过表达必需的核苷酸-糖生物合成途径来优化植物中LNFPI的生产。我们瞬时表达了LNFPI的生物合成途径（图2a）以及UDP半乳糖、UDP-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）和GDP岩藻糖的生产途径，并定量了LNFPI的生产（图2b）。与单独表达LNFPI途径（808.91μg g-1干重）相比，LNFPI通路与GDP岩藻糖通路的表达使LNFPI的产量增加了32.9%（1075.03μg-1干重量），表明GDP-岩藻糖在N. benthamiana中是有限的（图2c）。令人惊讶的是，尽管不表达α-1,3-或α-1,4-岩藻糖基转移酶，但GDP岩藻糖途径的过表达也导致了乳二岩藻四糖（LDFT）（m/z 635.2394）和乳-N-二岩藻六糖I（LNDFHI）（m/z1000.3720）的产生，这表明存在能够糖基化HMO的天然植物岩藻糖基转移酶。与单独表达LNFPI途径相比，所有其他核苷酸糖途径组合的过表达导致LNFPI产生水平相似或较低。图2. 核苷酸糖生物合成途径的操纵调节植物中HMO的分布。a. HMO生物合成途径表达用于生产LNFPI。b. LNFPI途径表达的核苷酸糖生物合成途径。c. 使用Agilent 6530 Accurate Mass Q-ToF MS获得的内部校准曲线，通过表达LNFPI生物合成途径以及组合表达的核苷酸-糖生物合成途径来量化LNFPI的产量。中间的条表示中位数。上须和下须分别对应于1.5×四分位数间距内的最大值和最小值。上铰链和下铰链分别代表第三四分位数和第一四分位数。使用异方差双尾t检验进行统计分析，以单独表达的LNFPI通路作为参考组*P<0.05。P值为：LNFPI+岩藻糖，0.030；LNFPI+GlcNAc，0.012；LNFPI+岩藻糖+GlcNAc，0.01；LNFPI+GlcNAc+Gal，0.01；LNFPI+岩藻糖+GlcNAc+Gal，0.043。每个实验使用三片叶子的样本量。d. 核苷酸糖生物合成途径过表达对使用LNFPI途径产生的HMO谱的影响。值反映了归一化的峰面积。使用m/z和MS/MS裂解法测定己糖、HexNAc、脱氧己糖（脱氧己糖）。我们在Agilent Q-ToF质谱仪上进行了质谱分析。
过表达核苷酸-糖生物合成途径改变了寡糖的总体分布（图2d）。通过m/z和MS/MS裂解鉴定确定每种鉴定的寡糖中己糖（Glc，Gal）、HexNAc（GlcNAc）和脱氧己糖（Fuc）的数量，并使用LNFPI校准曲线对峰面积进行归一化。与单独表达LNFPI通路相比，UDP-GlcNAc和LNFPI途径的过表达增加了含有己糖和HexNAc的中性寡糖的相对量（图2d）。GDP岩藻糖和LNFPI途径的过表达导致整体寡糖组成的变化，有利于生产含有至少一种脱氧己糖的寡糖，表明岩藻糖基寡糖水平的增加（图2d）。这些结果表明，调整核苷酸糖的可用性可以控制HMO的产生比例。
由于在植物中大规模生产HMO需要稳定转化的植物生长，我们开发了表达LNFPI生物合成途径的N.benthamiana转基因系。我们在转基因N.benthamiana中构建了两个构建体，用于2′FL和LNFPI的组成型生产（图3a）。HMO10含有编码产生乳糖所需的四种酶的基因，2′FL、LNTII、LNT和LNFPI通过2A肽连接，允许单个组成型启动子驱动多个编码序列。为了探索GDP-岩藻糖途径过表达部分的影响，我们还产生了表达HMO11的稳定系，HMO11含有来自GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd）。与中性HMO途径一起瞬时表达的Gmd以与完整GDP岩藻糖途径表达类似的方式改变了植物的HMO谱。图3. 在稳定转化的植物中生产HMO。a. 用于创建含有生物合成酶的稳定品系以生产LNFPI的构建体。b. 4周龄转基因N. benthamiana的照片。c. 各稳定品系叶片中产生的LNFPI浓度。d. 各稳定品系叶片中产生的2′FL浓度。为了定量，分别分析了每株植物的三片叶子。使用Thermo Fisher Scientific Q Exactive质谱仪对LNFPI和2′FL进行定量。LB，左边界；2A，2A肽；RB，右边界；Px，启动子；Tx，终端器；野生型。中间的条代表中位数。上须和下须分别对应于1.5×四分位数间距内的最大值和最小值。上铰链和下铰链分别代表第三四分位数和第一四分位数。每个实验使用三片叶子的样本量。
对转基因T0 HMO生产稳定系的岩藻糖基化HMO产量进行了评估。与野生型植物相比，大多数转基因植物没有表现出极端的表型（图3b），我们进行了定量PCR和逆转录（RT-qPCR）分析，以确认转基因的表达。在同时表达HMO10和HMO11的转基因N. benthamiana叶片中检测到LNFPI和2′FL。最高产量的LNFPI生产线累积的平均浓度为6.88µg g−1干重（图3c）。HMO11 5号叶片产生的2′FL浓度最高，平均浓度为130.35µg−1干重（图3d）。与瞬时表达相比，稳定品系中LNFPI的丰度较低，这可能表明由于2A肽的存在或较低的表达，β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶和β-1,3-半乳糖基转移酶的活性发生了改变。这些结果共同表明，有能力从光合作用固定的二氧化碳中生产和优化多种HMO，为未来创造高HMO产量的转基因植物用于商业HMO生产奠定了基础。
植物HMO的纯化及功能表征
益生元糖的混合物对有益肠道微生物的富集有不同的影响。因此，我们试图评估HMO生产植物提取物的双歧杆菌活性；然而，粗植物提取物可能含有干扰细菌生长测定的化学物质，如单糖（葡萄糖、果糖和蔗糖）和抗菌专用代谢物。因此，我们开发了一种方法，通过优化的提取和纯化工艺，从短暂表达LNFPI（图2a）和GDP岩藻糖（图2b）生物合成途径的N. benthamiana中提取和纯化HMO。简而言之，我们进行了水提取、酵母发酵以去除单糖，并用聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）和C18 SPE进行了两步树脂吸附。这导致了富含HMO的提取物，其中单糖和酚类化合物的含量可以忽略不计。HMO提取物含有目标岩藻糖基化HMO，包括LNFPI、2′FL和LNDFHI。提取物还含有各种没有指定结构的额外寡糖，由己糖、脱氧己糖和HexNAc糖的组合组成。这些代表了潜在的非天然寡糖结构，可以提供潜在的健康益处。总体而言，这些结果表明了从植物中分离HMO的能力，提高了它们作为HMO生产平台的前景。
为了评估植物产生的HMO的双歧杆菌活性，我们进行了生长试验，比较了植物产生的HMO和母乳来源的HMO对双歧杆菌的影响。我们选择评估植物来源的HMO对长双歧杆菌亚种的影响。婴儿ATCC 15697（BLI 15697），因为它是已知的HMO消费者。我们还纳入了动物双歧杆菌亚种。乳杆菌ATCC 27536（BLAC 27536）作为阴性对照，不消耗HMO，但会在植物提取物或母乳中可能存在的单糖上生长。在含有植物来源HMO的培养基中生长的BLI 15697显示出OD600 nm的光密度增加，与从母乳中分离的HMO中的BLI 5697相似，表明植物产生的HMO具有与从母乳分离的HMOs相同的选择性双歧杆菌活性（图4b）。正如预期的那样，BLAC 27536在植物来源的HMO或从母乳中分离的HMO中都没有生长，表明这两种提取物都含有极少量的单糖（图4b）。这些结果共同证明了纯化的植物产生的HMO能够模拟人类产生的HMO的双歧杆菌活性。
植物性HMO生产的经济可行性
如果基于工厂的HMO生产在当前最先进的生产路线中表现出成本竞争力或成本优势，那么它在商业上是可行的。为了评估在商业相关作物中生产HMO的经济可行性，我们开发了过程模型，并比较了植物和微生物中HMO生产的成本。为此，我们对LNFPI的理论产量进行了技术经济分析（TEA）。在植物系统中，我们采用了典型的纤维素生物精炼厂设计，使用高粱生物质与生物燃料共同生产HMO，因为在生物精炼厂共同生产增值生物产品是一种有前景的方法，可以最大限度地利用生物质，从而提高生物精炼厂的经济效益。我们假设生物质高粱可以在整个生物质中积累0.31%的LNFPI干重，因为这是我们纯化LNFPI后的最高产量。我们还开发了工艺模型，并使用已建立的工艺和同行评审论文中报告的LNFPI41的最高产量，对大肠杆菌中的HMO进行了TEA。对生产相同产品的植物和微生物系统进行比较，旨在深入了解系统的成本效益。
TEA结果表明，与微生物系统相比，从植物系统生产LNFPI在经济上更有利。在工厂系统中，当以纤维素乙醇售价销售乙醇时，LNFPI的最低售价（MSP）分别为4.9美元kg−1，当以目标燃料价格销售乙醇时为18.4美元kg−1（图5）。然而，基于微生物的LNFPI导致MSP为45.0 kg−1美元，下游回收和纯化是最大的成本贡献者，其次是葡萄糖的成本。微生物系统的高成本主要是由于其极低的最高报告产量（0.48%）和生物转化后的回收率（62%）。图5. 基于工厂的平台提高了生产HMO、LNFPI的经济性。在两种生物乙醇价格情景下，使用生物质高粱作为模型生产平台生产的LNFPI的估计MSP。误差带表示用输入参数的±20%计算的最终值。
03
结论
这些结果表明，当微生物宿主无法以相当的产量生产HMO时，植物可能是高价值产品的成本效益高的生物平台。除了植物系统的相对成本优势外，使用生物质作为原料共同生产高价值化合物和生物燃料还具有相当大的环境效益，因为生物质在生长过程中可以从大气中吸收二氧化碳。尽管目前模式植物N.benthamiana稳定品系中的HMO产量（图3）低于瞬时表达组织的产量，但通过优化用于生产稳定品系的HMO结构、寻找生产HMO的最佳作物种类和优化生长条件，可以实现高产。
DOI: https://doi.org/10.1038/s43016-024-00996-x
END
前期回顾
