《ACS Sustainable Chem. Eng》 通过逐层交联酶固定化提高β-半乳糖苷酶催化的转糖基化产率

2020年 8月，来自University of Melbourne的Sally L. Gras等人在ACS Sustainable Chem. Eng上发表了一篇题为Improving β‑Galactosidase-Catalyzed Transglycosylation Yields by Cross-Linked Layer-by-Layer Enzyme Immobilization 的研究性论文。

全球乳制品行业生产大量的乳制品副产品流，特别是奶酪、酪蛋白和酸奶制造过程中产生的乳清。乳糖稳定化—在功能性食品和药品的合成中使用乳糖—可以提高该行业的经济和环境可持续性。尽管在过去的30年里，从乳清流中分离蛋白质作为增值产品已经成为一种既定的过程，但乳糖的稳定化仍在开发中。产生的大量乳糖未被使用，因此被视为低价值流，对环境造成不利影响。开发这一丰富资源的一种解决方案是通过β-半乳糖苷酶催化的转半乳糖基化反应合成乳糖衍生的益生元，包括半乳糖寡糖或母乳寡糖。在转半乳糖基化反应中，乳糖通常作为半乳糖供体，比硝基苯基糖苷更便宜，毒性更小。

糖基转移酶可以以非常高的选择性和高产率催化这种益生元的形成。然而，糖基转移酶依赖于核苷作为供体，并且不易获得，这使得这一过程成本高昂。此外，大多数糖基转移酶也不能在供体或受体中发生变化。它们作用于活化的核苷酸供体，这种供体不稳定且昂贵；释放的核苷酸也可以强烈抑制这些酶的作用。鉴于这些局限性，催化转半乳糖基化的有利酶法是基于使用能够作用于乳糖作为起始底物的β-半乳糖苷酶。然而，在这种方法中，乳糖的水解可以与转半乳糖基化同时催化，导致产率和选择性降低。

研究人员已经开发了不同的方法，包括蛋白质工程、降低水分活度和优化操作参数，以提高转半乳糖基化产物的产量，而不是水解。在另一种方法中，在几项研究中，酶固定化已被证明可以提高转半乳糖基化效率。此外，固定化增加了控制反应的选择（通过反应时间控制），并简化了反应后的酶分离和再利用，同时提高了酶的储存和操作稳定性。β-半乳糖苷酶的热稳定性在固定后通常会增加。这对于转半乳糖基化反应来说是一个显著的优势，因为在高温下，更高浓度的起始底物可以溶解在溶液中，这有利于转半乳糖基化而不是水解。在环境温度下，乳糖在水溶液中的溶解度相对较低，在20°C下约为每100克水19克，而在60°C和80°C下分别为每100克水60克和100克，这表明在更高的温度下可以实现巨大的潜在收益。

二氧化硅因其热稳定性和机械稳定性、耐微生物性和无毒性而被广泛用作酶固定化的载体材料。这种二氧化硅载体是市售的，易于处理和合成。据报道，静电力而不是范德华力是控制酶在二氧化硅载体上吸附的主要力量。考虑到SiO₂和β-半乳糖苷酶的理论等电点分别为3-4和4.5，这种酶和二氧化硅载体之间的吸引静电相互作用不太可能很强，特别是在环状芽孢杆菌β-半乳糖酶的最佳pH值（pH=6）下，两者都带负电荷。这让酶更容易从载体上解吸，这在连续循环中的酶可重复使用性方面是有问题的。这个潜在的问题可以通过使用化学试剂修饰二氧化硅表面来激活其表面上的硅烷醇基团来克服。然后，硅烷化的SiO₂可以通过交联剂进一步处理，以制备共价固定酶，如β-半乳糖苷酶。

逐层组装是封装酶并且防止其从载体泄漏的另一种成熟方法。在这种技术中，吸附的蛋白质被带相反电荷的聚合物或聚电解质包覆。这是一种基于静电相互作用，将各种酶固定在不同载体上的简单且极其通用的技术。这种方法可以在温和的条件下在水溶液中进行，这对环境有利，并降低了酶降解的可能性。此外，这种方法允许共固定多种酶用于级联反应。另一方面，在硅基质上共价固定酶涉及使用危险和有毒的非水溶液，如有机硅烷试剂和甲苯，制备时间更长，酶变性的风险更大。由于产生了具有高化学和物理稳定性的非常坚固的对，聚苯乙烯磺酸盐（PSS）和聚烯丙基胺盐酸盐（PAH）已被广泛应用于逐层包封方法，包括酶的固定化。

虽然许多工作人员研究了共价固定β-半乳糖苷酶以生产半乳糖寡糖，但还没有研究分析逐层固定对转糖基化反应的影响。多层膜中产生的微环境和分子相互作用可能会对β-半乳糖苷酶的稳定性和水解/转半乳糖基化活性产生一些理想的影响。因此，在本研究中，我们研究了逐层交联技术固定环状芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的适用性。带负电的二氧化硅颗粒首先被带正电的多环芳烃包覆，然后带负电β-半乳糖苷酶静电吸附，与戊二醛交联，并沉积进一步的多环芳烃和PSS层。此外，首次对这种固定方法的经济性和可持续性进行了分析。

1.固定化酶的表征

TGA热分析图（见图1B）显示，与裸二氧化硅载体相比，固定化酶的二氧化硅颗粒在加热时的质量损失明显更大。200°C以下的质量损失是由于脱水造成的。多环芳烃侧链的分解始于230°C左右，随后是PSS中的磺酸基团。高温下的损失归因于主要聚合物骨架的降解。图1.( A )固定化酶(使用Hirox数码显微镜生成显微图像)后二氧化硅颗粒颜色的变化。观察到的固定化酶后二氧化硅颗粒颜色的类似变化。( B )对酶固定化前后的二氧化硅进行热重分析( TGA )，说明质量损失是加热的函数。

图2A显示了天然酶和固定化酶的ATR-FTIR光谱。二氧化硅颗粒在1070 cm-1处显示出一个宽峰，这是由Si-O的不对称振动引起的。酶的固定化产生了新的峰，特别是与C-O伸缩振动相关的酰胺I带（1600−1700 cm-1）和与N-H弯曲相关的酰胺II带（1510−1580 cm-1）。3000至3700 cm-1之间的新峰值表明N-H拉伸和侧链拉伸。此外，ζ电位测量揭示了表面电荷反转，证实了层的成功沉积（图2B）。特征酰胺I带对分子几何形状和氢键模式的微小变化高度敏感，可用于获得蛋白质二级结构成分的更详细信息。如图2C所示，使用逐层交联技术固定的β-半乳糖苷酶的构象发生了变化。之前已经报道过固定后条带的变化。Schwinté等人表明，将蛋白质包封在带相反电荷的聚电解质层（PAH或PSS）中可以增加分子间β-折叠含量。增强的蛋白质-蛋白质相互作用与分子间β-折叠的形成增加有关，这可能导致部分展开和变性。β-半乳糖苷酶二级结构的这种变化可能有助于其催化活性的改变。图2.(A) SiO2、天然酶和固定化酶的ATR-FTIR光谱。(B) 在pH=7.2的Tris缓冲液中逐层沉积的ζ电位测量。(C) 固定化酶和天然酶的酰胺I带的ATR-FTIR光谱。

2.固定化后β-半乳糖苷酶水解活性的评价

将β-半乳糖苷酶逐层包封在SIPERNAT 50 S颗粒上，酶剂量为2 mg·g^-1二氧化硅，蛋白质固定效率为100%。然而，固定化后的水解酶活性降低到22±2%。由于表面和酶之间的相互作用，这种活性降低在固定过程中很常见，这可能因所采用的固定方法而异。如图3所示，在本例中可能会发生静电、共价和蛋白质-蛋白质相互作用。带正电荷的多环芳烃可以在不同的位置与酶相互作用，因为酶在pH=6时主要带负电荷，这由红色表示，图3A中蓝色显示了一些有限的带正电荷区域，导致聚电解质-蛋白质复合物的形成。戊二醛中的醛基也可以与酶内的游离胺基形成共价键，如图3B中的绿色所示。共价结合通常会改变酶的活性。据报道，由于蛋白质-蛋白质相互作用，载体表面上的酶簇或多层可以形成。图3C显示了PSIVER服务器预测的β-半乳糖苷酶的蛋白质-蛋白质相互作用位点（黄色区域）。蛋白质-蛋白质相互作用占主导地位，因为较大的初始酶剂量与支持物接触，导致酶活性因空间位阻和有限的扩散而降低。

将酶剂量增加到10 mg·g⁻¹二氧化硅后，固定化后的β-半乳糖苷酶活性降低到17±2%，而所有酶蛋白仍被载体吸附。将酶剂量进一步增加到1000 mg·g⁻¹二氧化硅会降低活性，因此固定化后仅保留了0.6±0.4%的游离酶活性。此外，固定化效率降低到22±7%。在这种情况下，载体上负载的酶量的大幅增加（220±70 mg·g−1）导致了更多的蛋白质多层和相互作用。图3D显示了β-半乳糖苷酶的表面表示及其表面催化袋区（青色）。根据该图，图3A−C所示的相互作用可能会阻断该区域，阻碍底物有效地进入酶。

研究人员还研究了乳糖预处理对固定化过程中酶活性损失的影响。据报道，乳糖与β-半乳糖苷酶活性位点的结合可以作为屏蔽，防止活性位点附近共价键的形成。然而，与未经乳糖预处理的固定化酶相比，这种保护方法没有导致酶活性的任何显著变化。这一结果表明，共价键以外的相互作用在这种逐层交联组装中的酶构象变化中起着重要作用。

图3.(A)在pH 6下估计的酶的泊松-玻尔兹曼静电表面电势显示带负电荷区域（红色）、不带电荷区域（白色）和带正电荷区域（蓝色）。(B) 酶的游离胺基（绿色），可能与戊二醛发生反应。(C)参与酶-酶相互作用的表面区域（黄色）由PSIVER（蛋白质-蛋白质相互作用位点预测服务器）预测。(D)酶的3D表面结构显示了其催化袋的区域（青色）。可视化是使用Chimera软件生成的，3D结构是从蛋白质数据库（PDB）中获得的，代码为4YPJ。（A）至（C）中给出了酶的四种不同观点。

3.转半乳糖基化反应

然后将每克二氧化硅负载2mg酶的固定化生物催化剂用于转半乳糖基化反应。从0.14 U·mL⁻¹的相同初始水解活性开始（对应于40μg·mL^-1的固定化酶和8μg·mL-1的游离酶），在每个时间点，固定化酶产生的LacNAc比游离酶多约2倍至3倍（图4A）。固定化酶的初始转半乳糖基化速率（r_trans）与水解速率（r_hydro）的比值比游离酶大7倍（图4B）。即使游离酶浓度增加到0.63 U·mL^-1（相当于游离酶的36μg·mL^-1），这相当于固定化酶的初始转半乳糖基化活性，由于水解反应的竞争，LacNAc的产量随着时间的推移也没有达到与固定化酶反应观察到的水平（图4A）。这是一个重要的结果，表明本研究中采用的固定化技术不仅可以在反应后回收酶，而且可以提高产量，这会显著影响大规模LacNAc生产的经济性。为了进一步阐明，如图4C所示，分别在0.63 U·mL^-1（90分钟）的游离酶和0.14 U·mL⁻¹（150分钟）的固定化酶催化的反应中获得最高LacNAc浓度的两个时间点计算了反应比生产率（也称为生物催化生产率）。当使用游离酶时，使用0.63 U·mL^-1而不是0.14 U·mL⁻¹可以获得更多的LacNAc，但以降低比生产率为代价。相比之下，在任何一个时间点，0.14 U·mL^-1固定化酶催化的反应的比生产率都大于0.63 U·mL⁻¹游离酶的反应。游离酶的比生产率为0.14 U·mL⁻¹，这是由于在相同的水解活性下，固定化酶的酶质量浓度较低（8μg·mL⁻¹）（40μg·mL^-1）。尽管如此，重复使用固定化酶的能力可以弥补活性的损失。几位研究人员报告了β-半乳糖苷酶固定化后转半乳糖基化产率和反应生产率的变化。

如前所述，高浓度的二价阳离子，即100 mM Ca²⁺或100 mM Mg²⁺，会导致带负电荷的β半乳糖苷酶和随后的蛋白质聚集之间形成盐桥。因此，在本研究中，我们还研究了使用固定化酶时这些阳离子对产物形成的影响。如图4A所示，在100 mM Ca²⁺或Mg²⁺存在的情况下，没有观察到LacNAc浓度的显著变化。这一结果表明，酶被很好地包裹在载体中，无法与相邻分子形成聚集体。这也证实了我们之前的结论，即这些阳离子没有作为这种酶的辅因子的作用。

在之前的工作中，开发了一个动力学模型来描述乳糖转化为LacNAc过程中涉及的多途径反应，包括转半乳糖基化和水解。基于该模型（见支持信息），估算了游离酶和固定化酶的反应速率常数。改变的动力学参数表明催化活性位点的变化和/或对底物扩散到逐层涂层中的限制，这降低了固定化后的反应速率常数。重要的是，游离酶的LacNAc合成速率常数（k_{3）与半乳糖释放速率常数（k2）的比值为14M}^{-1，而固定化酶的比值约为20M-1，这表明转半乳糖基化得到了改善。}

图4.（A）在50°C下使用固定化酶和游离酶合成LacNAc的时间过程，初始乳糖和GlcNAc浓度分别为50和500 mM。（B）固定化酶和游离酶的转半乳糖基化与水解速率之比。（C） 使用固定化酶或游离酶反应90和150分钟后LacNAc的比生产率。

4.固定化酶与游离酶的热稳定性

在55°C下90分钟和180分钟后，固定化酶可以分别保持约92%和83%的初始活性（图5A），而30分钟后，游离酶的初始活性仅保持8%（图5B）。这意味着，使用固定化酶，可以在高温下进行反应，从而以更高的反应速率进行反应。在更高的温度下，固定化酶开始更快地变性（图5C），因此在70°C下，残留活性更具可比性（15分钟后游离酶为7%，固定化为15%）。这一观察结果与表1所示的失活速率常数（k_D）数据一致。然而，即使在70°C下，固定化酶仍然具有更强的热稳定性。

表1.固定化和游离酶的失活速率常数（k_D）、半时间值（t_1/2）和热变性反应的活化能（Ea）^a

热变性反应的活化能（E_a），或触发酶失活所需的最小能量，游离酶为53±1 kJ mol-1，固定化酶为294±2 kJ mol－1（表1）。固定化酶的E_a较高，是游离酶的5倍以上，这证实了交联逐层固定化技术作为提高β-半乳糖苷酶热稳定性的方法的适用性。

固定化酶观察到的正ΔS（表2）直接表明了失活过程中蛋白质的去折叠（更大的紊乱）。相比之下，游离酶的相应负ΔS值可能与变性导致的失活过程中蛋白质聚集体的形成有关。与在溶液中自由移动的可溶性蛋白质相比，聚集体的无序程度较低，因此ΔS值为负。

ΔH的正值表明β-半乳糖苷酶的热失活是一种吸热反应，游离酶与固定化酶的ΔH值的差异意味着需要更多的能量来破坏固定化形式的稳定性（表2）。酶和聚电解质之间相互作用形成的静电笼可以限制结构波动，从而提高蛋白质内部的结构稳定性。已经证明，蛋白质中更大的β-折叠含量也会导致更刚性的蛋白质结构。如上所述，固定化酶的傅里叶变换红外光谱与二级结构确认的这种变化以及固定化后更刚性结构的形成是一致的。

固定化酶和游离酶也在这些高温下孵育30分钟，然后在50°C下测量剩余的转半乳糖基化活性。在55°C下孵育的固定化酶的转半乳糖基化活性没有变化，而在60°C下孵化固定化酶后，约86%的活性得以保留（图6）。在高于β-半乳糖苷酶最适温度（50°C）的温度下孵育后，观察到游离酶的活性显著降低。

表2. 固定化酶和游离酶热失活的热力学参数

图5. （A）固定化酶和（B）游离酶的残余活性与高温下孵育时间的自然对数。（C） 热失活速率常数与绝对温度倒数的自然对数。

图6. 与未孵育的相同酶的情况相比，在高温下孵育30分钟后，固定化酶和游离酶的转半乳糖基化活性。所有活性测试均在50°C下进行10分钟。

5.固定化酶的操作稳定性

将含有固定化酶（0.14 U·mL^-1）但不含底物的对照样品在50°C下孵育150分钟（在转半乳糖基化反应的相同条件下），然后通过离心分离上清液。当测量上清液的蛋白质含量时，在该孵育过程中没有发现酶从支持物中释放出来。这是交联逐层封装的一个重要优点。还研究了固定化β-半乳糖苷酶在连续反应中的可重复使用性，因为这是评估固定化在工业应用中的有用性的关键因素之一。经过八次重复使用循环后，没有观察到LacNAc的摩尔产率显著降低（图7A），表明通过这种方法固定的β-半乳糖苷酶具有良好的操作稳定性。

6.初步经济分析结果

之前已经使用这种β-半乳糖苷酶开发了一种LacNAc生产过程的模拟。现在，该模拟用于比较从20吨乳清乳糖中获得的LacNAc的量，以及游离酶和固定化酶的LacNAb生产年成本。结果表明使用固定化酶每年生产8.5吨LacNAc，使用游离酶每年生产6.3吨LacNAb。这两种模拟使用了提供相同初始转半乳糖基化活性的酶浓度：固定化情况为0.14 U·mL^-1（40μg·mL^-1），游离酶为0.63 U·mL⁻¹（36μg·mL^-1）。在生产规模上固定酶的成本估计为104美元 kg⁻¹的固定化载体。

基于固定化酶的八个重复使用周期的工艺，每公斤产品的原材料年成本为149美元，而基于游离酶的工艺为178美元。这种差异反映了使用固定化酶时获得的更高产量。在不重复使用固定化生物催化剂的情况下，总原料成本的72%来自酶的固定化，而游离酶成本在总原料成本中的份额约为19%。这一发现与之前报道的结果一致。然而，随着重用周期数量的增加，这一比例下降，因此在11个重用周期后，这些成本是相当的。

然后计算净现值（NPV）作为项目盈利能力的指标。基于固定化酶的工厂每年加工20吨乳糖的净现值（4.63亿美元）大于基于游离酶的工艺的净现值。净现值的增加主要是由于固定化后产量的增加。如图4A所示，从相同的初始转半乳糖基化活性和50 mM的乳糖浓度开始，当使用固定化酶时，LacNAc的摩尔产率约为50%，而游离酶的摩尔产率为35%。对于这两种酶类型，工艺成本彼此接近，因为设备尺寸没有变化，尽管在这种情况下，固定会产生额外的成本。尽管如此，在每批中，当使用固定化酶时，用相同量的乳糖生产出更多的LacNAc，这表明年收入更高。图7B还显示了固定化酶再利用对NPV影响的进一步分析。根据该图，当再利用次数增加到约10次时，净现值的变化是显著的。假设产品的产量不变，净现值进一步增加对更高的再利用次数来说并不十分显著。

酶固定化过程的洗涤循环中使用的水可以回收用于生产新鲜的聚电解质和酶溶液，因此假设水回收率为90%。由于固定化酶可以回收至少八次，净用水量变小，仅为14kg/kg LacNAc。在该固定化过程中，离心产生的净用电量也很低（0.004 kWh/kg LacNAc）。在增加了每公斤产品产生的总废物和消耗的水。尽管如此，可以假设来自该洗涤步骤的大部分水可以再循环到反应器中，因此90%的水回收率再次用于该步骤。

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结论

DOI: https://dx.doi.org/10.1021/acssuschemeng.0c05186