《Food Chemistry》α-1,6-葡聚糖酶底物结合槽处的保守残基Glu和Phe调节产物的分支

2023年6月，来自江南大学的Shixia Xi等人在Food Chemistry上发表了一篇题为Conserved residues Glu and Phe at substrate binding groove of α-1,6-glucanases modulate branch of the product的研究性论文。

使用来自糖苷水解酶家族13（GH 13）的α-1，6-葡聚糖酶产生的具有α-1，6-连接分支的α-葡聚糖在营养和医药方面的应用特别有吸引力。先前的一项研究报告称，具有分支的α-葡聚糖在小肠中抵抗消化，这对于预防和管理饮食相关疾病是理想的。此外，支化程度限定了每个样品的物理化学和生物学性质以及应用范围。α-1，6-葡聚糖酶中催化α-1，6糖苷键的残基的提取对于生产具有分支度的产物至关重要。

α-1，6-葡聚糖酶催化底物中的α-1，6糖苷键，并涉及七个GH 13亚家族。在α-1，6糖苷键上具有活性的GH 13亚家族包括GH13_8、GH13_9、GH13_11、GH13_12、GH13_13、GH13_14和GH13_41亚家族。GH13_8和GH13_9亚家族中的酶是一种1，4-α-葡聚糖分支酶（GBE，EC2.4.1.18）。

GBE是负责转糖基化和形成α-1，6糖苷键的酶。GH13_11、GH13_12、GH13_13、GH13_14和GH13_41亚家族中的酶是葡聚糖去支化酶（GDE，EC 3.2.1.68和3.2.1.33）、异淀粉酶（ISO，EC3.2.1.68）和支链淀粉酶（PUL，EC3.2.1.41）。这些酶（GDE、ISO和PUL）裂解底物的α-1，6糖苷键。上述所有催化α-1，6糖苷键的酶在底物和产物方面形成相对异质的基团。因此，发掘了α-1，6-葡聚糖酶中催化α-1，6糖苷键的氨基酸残基，涵盖了对α-1，6糖苷键有活性的GH 13亚家族。

文献中报道了一些催化α-1，6糖苷键的残基，Val和Trp。与催化亲核试剂相邻的缬氨酸（V195）对于链球菌GH13_31酶的α-1，6活性是重要的。变异株（PDB ID：2 ZIC），因为V195 A突变体改变了对α-1，4-活性的特异性。交替蔗糖酶的3D结构显示，亚位点+ 2处的残基W675定向受体结合，只倾向于α-1，6连接合成。此外，α-岩藻糖苷酶还在活性位点附近形成一个芳香亚位点，在α-1，6键中容纳N-乙酰葡糖胺。尽管已经报道了许多调节酶的α-1，6-连接特异性的氨基酸残基，但这些残基是否适用于α-1，6-葡聚糖酶还不清楚。

基于上述结果，在α-1，6-葡聚糖酶中挖掘出了催化α-1，6糖苷键的氨基酸残基，涵盖了对α-1，6糖苷键有活性的GH 13亚家族。研究了

1.亚家族内保守位点的鉴定

研究人员收集了GH 13亚家族的蛋白质序列，以鉴定与α-1，6糖苷键的结合、形成或裂解相关的保守位点和氨基酸残基。共筛选出7个亚家族，包括3个与α-1，6糖苷键形成相关的亚家族和6个与α-1，6糖苷键降解相关的亚家族（图1A）。共筛选出330条序列，用于筛选7个亚家族的保守位点。每个亚家族至少有44个不同的实例。(图1A）。对蛋白质序列的所有残基进行比对，并使用Shannon熵方法计算熵，以识别高度保守的位置（图1B）。Shannon熵用于根据方程确定保守位点。H(X) = −∑xP(x)log2[P(x)]。

式中P是×事件的概率。根据定义，熵测量一系列事件中的变化或变。因此，不变的模式，例如在没有序列多样性的位置上的氨基酸残基，具有零熵。相反地，位置改变的氨基酸残基具有大于零的熵。具有零熵的位置被认为是保守位点。

图1.针对α-1，6糖苷键的七个亚家族中保守位点的预测。(A)GH 13亚科的系统发育树。紫色分支代表催化底物的α-1，6糖苷键的亚家族中的酶。右边的数字代表每个亚家族中选择用于保守热点研究的序列数量。(B)保守位点被定义为Shannon熵为零的位点。在序列比对后，使用窗口计算氨基酸残基的Shannon熵。每个位置的Shannon熵被筛选并投影到结构模型中。

2.保守位点靶向α-1，6糖苷键

期望在预测的保守位点发现富集的位点。在α-1，6糖苷键上有活性的亚家族中有一个保守位点，其熵值为零。通过对这7个亚家族α-1，6糖苷键保守位点的交叉分析，得到了11个共有的保守位点。11个保守位点分别是343、521、521、523、570、575、749、751、814、979和980。(图2A）。位于11个保守位点的氨基酸显示在图2B中。GH13_41在保守位点343和521处的氨基酸分别不同于GH13_8、GH13_9、GH13_11、GH13_12、GH13_13和GH13_14。这可能是因为由酶和GH13_41催化的糖苷键的类型不同于其他亚家族中的糖苷键。例如，GH13_41中的酶可以水解α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键。因此，在下面的实验中忽略了GH13_41的保守位点。

RoGBE中11个保守位点的对应位置为148、198、199、200、235、240、303、305、356、423和424。RoGBE中的保守位点199、200、235、240、303、305、356、423和424在所有亚家族中是保守的（图2C、图2D）。对应于RoGBE中的199、200、235、240、303、305、356、423和424的保守位点522、523、570、575、749、751、814、979和980在对多个糖苷键有活性的GH 13中是保守的。因此，这些保守位点不是酶催化α-1，6糖苷键的关键位点。忽略上述8个保守位点，保守位点343和521在α-1，6糖苷键活性亚家族中均是保守的。

图2.确认参与α-1，6糖苷键催化的酶的保守位点。(A)保守位点在α-1，6糖苷键上有活性的亚家族内重叠。(B)保守位点中的保守氨基酸残基。(C)从GH 13家族中的所有子家族生成的位置概率矩阵。矩阵显示为序列标志，其中字母高度对应于该区域的氨基酸概率。(D)从GH 13家族中所有亚家族的520至530个位点生成的位置概率矩阵。

3.保守位点的结构表征

对于每个亚家族，我们从最密集的结构中选择了一个代表。将来自所选结构模型的蛋白质序列添加到比对中，并且将总共11个保守位点映射到相应亚家族的3D模型中（图3）。所有保守位点均位于催化结构域的中心，催化结构域由八个螺旋和八条链组成（图3）。这一结果表明，保守位点具有优势的位置。

图3.GH13_8：3AML、GH13_9：5GQX、GH13_11：4OKD、GH13_12：3FAX、GH13_13：6J4H和GH13_14：3WDH等5个亚家族的保守热点的结构特征。在所有GH13亚家族中保守的保守位点522、523、570、575、749、751、814、979和980用紫色球体表示。保守位点343和521由红色球体表示响。

为了更好地理解酶中的保守位点如何调节连接特异性，详细地研究了在底物的α-1，6糖苷键上活性的亚家族内重叠的位点。如图4所示，W521位于柔性催化环，而E343位于α/β折叠桶的一条链。E343位于β链的起始处，具有非常低的B因子。W521热点位于ɑ7和ɑ8之间的环上，具有很高的B因子（图5）。此外，W521与基底之间的距离小于4 Å。E343与基底之间的距离大于6 μm。343的位置和距离表明它不太可能折叠并移动到更靠近底物的位置，而具有高B因子的W521更可能参与底物结合。

4.W521决定酶的α-1，6键并改变产物结构

RoGBE中的两个保守位点E343和W/F521对应于位点E148和W198。将E148突变为Asp（D）、Lys（K）、Gln（Q）、Arg（R）和Trp（W），并将保守的热点W198突变为Ala（A）、Asp（D）、Phe（F）、His（H）和Tyr（Y）。突变体的转苷和水解活性分别用于评估其切割α-1，4糖苷键和形成α-1，6糖苷键的能力。突变体W198 A、W198 F、W198 H和W198 Y显示出低转糖苷活性，并且W198 D显示出转糖苷活性的丧失（图6A）。突变体W198F、W198H和W198Y的水解活性增加，如图6B所示。转糖苷和水解活性的变化表明产物结构的改变。

5.E343决定酶的α-1，6键并改变产物结构

保守热点E343（对应于RoGBE中的位点E148）突变为Asp（D）、Lys（K）、Gln（Q）、Arg（R）和Trp（W）。E148 D、E148 K、E148 Q和E148 R显示出急剧降低的转糖苷活性（图8A），并且E148 W显示出转糖苷活性的完全丧失。然而，保守的热点148突变诱导对水解活性的轻微影响（图8A，图8B）。活性结果与148位突变的分子大小分布一致。直链淀粉和支链淀粉的分子量分别取决于GBE水解α-1，4糖苷键和反式β-糖苷酶形成新分支点的过程。在WT和突变体修饰后，直链淀粉的Mw转变为较低值（图8C）。这表明突变体的水解能力仍然保留。支链淀粉的Mw也转移到比WT产品更低的值，表明转糖基化能力降低。此外，还测定了淀粉-碘的吸收光谱，这表明单突变体的产物是不同的。单一突变体E148 W和对照的产物在约610 nm处显示出强吸收峰（吸光度= 2.82），表明形成了直链淀粉-碘复合物（图8D）。然而，E148 K、E148 Q和E148 R的产物分别在约510 nm、530 nm和560 nm处显示出强吸收峰。这些产物在λmax上显示出明显的红移，表明突变体将淀粉改性成具有较低聚合度的较短链。

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结论

DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2023.135510