2024年12月，来自Technical University of Denmark和Universidade Federal do Rio de Janeiro的Roberta P. Espinheira等人在Journal of Agricultural and Food Chemistry上发表了一篇题为Discovery and Characterization of Mannan-Specialized GH5 Endo-1,4-β-mannanases: a Strategy for Açaí (Euterpe oleracea Mart.) Seeds Upgrading的研究性论文。

阿萨伊棕榈（Euterpe oleracea Mart.）生产巴西亚马逊最有价值的水果之一，被称为阿萨伊果。这些深紫色的水果经过加工以提取果肉，这些果肉要么在当地消费，要么经过干燥或冷冻过程出口并用于各种食品，例如冰沙、酸奶和糖果。2022年，巴西生产了190万吨阿萨伊，与2015年相比增长了60%。不幸的是，阿萨伊的生产对环境产生了负面影响，因为可食用部分仅占水果的15%，每年留下约160万吨种子作为废物，大部分被丢弃在垃圾填埋场。虽然目前已被丢弃，但阿萨伊种子含有约50%的β-甘露聚糖，与其他常见的含β-甘露聚糖的农工残留物相比，其含量也很高。这一特性使阿萨伊种子成为β-甘露聚糖和β-甘露聚糖寡糖的宝贵天然来源，众所周知，它们具有益生元活性。

β-甘露聚糖分为半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖和线性甘露聚糖。由于阿萨伊种子的碳水化合物组成显示出低百分比的半乳糖和葡萄糖，并且其晶体分布与1型线性β甘露聚糖相容，这些种子的β-甘露聚糖被推断为以线性形式组织，从而产生晶体组装体，就像在象牙坚果中发现的β-甘露聚糖类型。因此，阿萨伊种子的线性β-甘露聚糖可用于通过酶催化解聚直接生产β-甘露寡糖 （β-MOS）和甘露糖。然而，堆积的β-甘露聚糖链赋予了结晶性和抵抗酶攻击的能力，削弱了这一任务。

内切-1,4-β-甘露聚糖酶（E.C. 3.2.1.78）催化1,4-β-D-甘露聚糖内键的裂解。根据碳水化合物活性酶（CAZy）数据库（http://www.cazy.org/），内切-1,4-β-甘露聚糖酶分为四个糖基水解酶家族（GH），GH5、GH26、GH45和GH113，其中GH5和GH26家族含有大多数内切作用β-甘露聚糖酶。不同的因素会影响 内切-1,4-β-甘露聚糖酶对β-甘露聚糖的特异性。例如，研究表明，结合亚位点的数量和特异性以及催化机制会影响水解效率和特异性，如GH5和GH26内切-1,4-β-甘露聚糖酶的比较所示。

很少有研究检测未经处理的阿萨伊种子中β-甘露聚糖的酶水解，而那些报道在水解24-72小时后产量较低的研究。这些低得率的阿萨伊种子酶解不仅与材料的顽固性有关，而且与β-甘露聚糖酶对线性甘露聚糖的特异性知之甚少有关。因此，发现更多专一的内切-1,4-β-甘露聚糖酶和了解线性甘露聚糖水解的生化机制对于阿萨伊种子的可持续利用至关重要。

如今，各种生物信息学工具有助于酶的发现。碳水化合物活性酶（CAZymes）根据序列和三维折叠分为家族。尽管非常有用，但这种分类并不能直接识别酶功能，因为几个CAZy家族包含催化不同反应的成员，将具有不同分子功能的酶聚集在一起。CAZy数据库中的家族和亚家族描述可以通过非比对工具进一步细化，例如基于肽的聚类方法，该方法可识别保守的独特肽模式（CUPP）。CUPP算法根据将蛋白质分成长度为8个氨基酸的小肽片段（其中两个是模棱两可的）来对蛋白质序列进行聚类，然后将这些肽片段与代表不同CUPP基团的保守肽片段库进行比较和分组。因此，这种方法可以将酶进一步细分为功能相似性的组。

因此，本研究的目的是鉴定可能专门用于线性甘露聚糖水解的真菌内切-1,4-β-甘露聚糖酶。真菌β-甘露聚糖酶被特别选择，因为与其他酶来源相比，它们在降解复杂、顽固的有机底物方面具有更广泛的多功能性。CUPP被用作将真菌酶与来自Elaeis guineensis（油棕）基因组的未表征的β-甘露聚糖酶序列聚集的工具——被认为是与E. oleracea Mart.（阿萨伊棕榈）的近亲植物学亲戚，没有可用的基因组序列。此外，该研究旨在克隆、表达和纯化棕榈和真菌酶，并对它们进行生化表征。通过这样做，本研究旨在增强对线性β-甘露聚糖的酶催化水解的理解，并为开发阿萨伊种子可持续利用的新策略提供见解。

1.Cupp Clustering、序列分析和异源表达

为了发现真菌内切-1,4-β-甘露聚糖酶可能专门用于阿萨伊种子中线性甘露聚糖的水解，我们检查了先前关于阿萨伊种子萌发不同阶段蛋白质组动力学研究的数据。这种方法利用了这样一个事实，即在发芽过程中水解线性甘露聚糖储存所需的植物酶可以为鉴定更擅长线性甘露聚糖水解的未鉴定和推定的真菌β-甘露聚糖酶提供良好的序列输入。由于目前没有阿萨伊基因组，前面提到的蛋白质组学分析使用阿萨伊（Arecaceae）数据库的系统发育家族作为参考来鉴定蛋白质。在发芽过程中观察到五种与阿萨伊内切-β-甘露聚糖酶同源的未鉴定或推定的内切-β-甘露糖聚糖酶。这五种酶——来自油棕Elaeis guineensis的XP_010911540.1和XP_010943133.2，以及来自椰枣Phoenix dactylifera的XP_008805817.3、XP_008778491.2和XP_017700190.1——属于GH5家族第7亚科。XP_010911540.1与XP_008805817.3同源，XP_010943133.2与XP_00778491.2同源。所有这些都被CUPP归类为内切-1,4-β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78），并归入同一CUPP簇：GH5:36:1。这些酶为本研究中真菌酶的发现提供了参考。

最初，通过序列比对鉴定真菌候选酶。使用CUPP进一步分析具有最高相似性的序列，CUPP是一种基于非比对的工具，基于将酶蛋白组织成具有相似基序组的组。基序组基于8个氨基酸的肽片段，其中2个是模棱两可的；这种聚类还可以对包含不同功能酶的CAZyme家族成员进行功能注释（如CAZymes的GH5家族）。

比对的真菌序列也被归类为GH5家族7亚家族内的内切-1,4-β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）。虽然大多数被分配到不同的CUPP组，但有些被注释为与植物β-甘露聚糖酶GH5:36.1属于同一CUPP组（数据未显示）。从GH5:36.1 CUPP组中选择五个真菌序列（XP_007324538.1、KAF8922466.1、KAF5375179.1、KDQ56244.1和KAF8642254.1）进行合成、克隆和表达。值得注意的是，CUPP数据库的后续更新，增加了1000多个真菌基因组，完善了CUPP聚类过程。因此，最初归入GH5:36.1 CUPP组的真菌和植物序列已被重新分配到不同的组。然而，它们之前在GH5:36.1中的分类仍然表明它们之间存在很大程度的肽相似性。

根据之前的分析选择的植物和真菌序列中，只有来自油棕（植物）的EgMan5A（XP_010911540.1）、来自Jaapia argilacea（真菌）的KDQ56244.1（JaMan5A）、XP_007324538.1（SlMan5A）和来自Serpula lacrymans（真菌）在P. pastoris中成功重组表达，表达后纯化酶。EgMan5A、JaMan5A和SlMan5A的预测分子量分别为41.5、49.2和49.7 kDa，凝胶分析表明纯化的EgMan5A表现出预期的质量，而另外两种纯化的蛋白质表现出比预期更高的分子量，这可能是由于糖基化。事实上，JaMan5A和SlMan5A的N-糖基化位点预测结果为5个位点，EgMan5A没有（数据未显示）。因此，使用EndoH对两种真菌蛋白进行酶解糖基化，并在处理后显示出预期的质量。由于蛋白质糖基化与折叠和稳定有关，直接影响酶的半衰期、降解和变性，JaMan5A和SlMan5A的糖基化可能会影响其整体稳定性。此外，通过使用抗His标签单克隆抗体的蛋白质印迹分析证实了靶酶的表达。为了确认表达的酶的活性，使用象牙坚果甘露聚糖作为底物进行了终点延伸测定（数据未显示）。这三种酶都表现出甘露聚糖分解活性，释放还原糖作为产物。

2.EgMan5A、JaMan5A和SlMan5A反应条件的优化，热稳定性和动力学

以象牙坚果甘露聚糖为底物，研究了pH值和温度对酶活性的影响，因为其化学和结构与阿萨伊种子甘露聚糖相似。通过实验设计，使用实验设计（FCCD）模型对数据进行分析，该模型结合了基于每种酶的初步实验的pH和温度范围内的反应条件。结果如响应面图所示（图1）。

图1. （A）EgMan5A、（B）JaMan5A和（C）SlMan5A水解象牙坚果（1%）的初始速率（μM/min）的响应面图，作为pH和温度的函数。以面为中心的中心复合设计，用于预测最佳pH值和温度。黑点代表用于构建模型的实际实验数据。

根据该模型，EgMan5A的最佳pH值为5.3，温度为59°C（表1），高于据报道在50°C下具有最佳活性的GH5_7大豆β-甘露聚糖酶，但低于据报道的椰子β-甘露聚糖酶最佳温度70°C。JaMan5A和SlMan5A分别在63和72°C以及pH 4.2和4.4时具有最佳活性（表1）；这些最佳值与其他GH5真菌β-甘露聚糖酶的报道值相当。（35,36）实验验证了EgMan5A和SlMan5A在模型预测的最佳条件下水解象牙坚果甘露聚糖时的预期初始速率（图1），对应于13和92μM/min（表1）。同时，JaMan5A的R2为0.88，其实验初始速率为55μM/min，略高于预测值（表1）。

表1. 象牙坚果甘露聚糖（1%）水解的最佳条件

通过评估1小时培养过程中的残留初始速率，分析了在最佳温度和10°C以下及以上温度下的酶稳定性。结果用于估算热力学参数，包括每种酶的熔化温度（Tm）和半衰期，如表2所示。

EgMan5A在50°C下需要大约2小时才能达到天然初始速率的一半。相比之下，EgMan5A表现出比大豆β-甘露聚糖酶更高的热稳定性，在50°C下监测0.5小时时，大豆β-甘露糖聚糖酶失去了80%的活性，在45°C下，拟南芥β-甘露聚糖酶在2小时内失去了70%的活性。当温度在60和70°C下升高到与SlMan5A相当的条件时，EgMan5A变得不太稳定，半衰期比SlMan5A低约30倍。影响热稳定性的因素之一是N-糖基化，N-糖基基化预测表明EgMan5A没有N-糖基性位点，SlMan5A有5个位点。JaMan5A在55°C下的半衰期为5小时，SlMan5A在60°C下为16.5小时。JaMan5A显示了来自Trichoderma asperellum的GH5β-甘露聚糖酶的类似半衰期，在55°C下的半衰期为4小时。在黑曲霉的β-甘露聚糖酶中发现了与SlMan5A类似的热稳定性，该酶在60和70°C下孵育2小时后仍保持高残留活性。在每种酶测试的较低温度下，所有三种酶在测定时间内都是热稳定的（表2）。关于Tm，EgMan5A是最不耐热的酶，Tm为60°C。对于JaMan5A和SlMan5A值，Tm分别为70和78°C。已有报道称，来自黑曲霉及其突变体的β-甘露聚糖酶的Tm值相似。在所测试的β-甘露聚糖酶中，SlMan5A的热稳定性最高。

表2. 酶在最佳温度和±10°C下的半衰期和熔化温度（Tm）

随后，在最佳条件下测定不同浓度象牙坚果甘露聚糖的酶速率，绘制图表，并使用Michaelis-Menten方程进行建模（图2）。

图2. 在最佳温度和pH值下，象牙坚果浓度对初始速率（V和μM/min）的影响。蓝色三角形：SlMan5A:70°C和pH 4.4；黑色方块：JaMan5A:65°C，pH 4.2；红色圆圈：EgMan5A，温度为60°C，pH值为5.3；红线代表Michaelis-Menten建模，调整后的R2为99%（SlMan5A）、95%（JaMan5A）和91%（EgMan5A）。

如图2所示，酶的所有三个催化位点都被约10-20mg/mL的象牙坚果甘露聚糖饱和。在计算动力学参数时注意到酶速率的变化（表3）。所有三种酶对象牙坚果甘露聚糖的表观米氏常数（KM）相似，而催化常数（kcat）和特异性常数（kcat/KM）在统计学上不同（表3）。因此，EgMan5A显示了三种酶中较低的kcat，反过来，这种酶的kcat/KM也最低（表3）。预期EgMan5A的kcat/KM较低，因为它是在最低温度下测试的，在所有其他条件相同的情况下，反应速率预计会较低。此外，EgMan5A是一种植物来源的酶，其进化设计用于维持植物代谢并在细胞内发挥作用。因此，这些酶的作用与真菌水解酶不同，真菌水解酶通常是分泌和进化的，作为酶组合的一部分尽可能有效地发挥作用，以确保真菌有足够的碳供应。当用刺槐豆胶作为底物测试大豆β-甘露聚糖酶时，观察到类似的kcal/KM（0.72 mg s-1）。SlMan5A的kcal/KM几乎是JaMan5A的两倍，使SlMan5A成为水解象牙坚果甘露聚糖最有效的酶，kcal/KM为2.2 mg s-1 mL-1。值得注意的是，SlMan5A与JaMan5A相比效率更高，这可能是由于SlMan5A的最佳温度更高，反映了更高的测定温度。在报告β-甘露聚糖酶的动力学参数时，大多数研究不使用象牙坚果甘露聚糖作为底物，阻碍了本研究与先前发现的比较。然而，对GH5真菌β-甘露聚糖酶对刺槐豆和魔芋胶动力学的研究报告了相似的KM和kcat值。此外，一项研究显示了真菌GH5β-甘露聚糖酶对象牙坚果甘露聚糖和其他β-甘露聚糖底物的动力学参数，并得出结论，该酶在水解葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖底物时更有效。

表3. 从Michaelis-Menten模型获得的象牙坚果甘露聚糖水解时的酶动力学参数

3.EgMan5A、JaMan5A和SlMan5A对β-甘露聚糖底物的特异性

测试了表达的酶对各种β-甘露聚糖底物的比活性（U/mg酶），并将其与两种市售的β-甘露聚糖酶（表4）进行了比较，即BGM“Amano”10和日本血吸虫的GH26内切-1,4-β-甘露甘露聚糖酶。关于线性甘露聚糖底物，象牙坚果甘露聚糖被所有酶水解，以及1,4-β-D-甘露聚糖，与象牙坚果甘露甘露聚糖相比，由于其较低的聚合度（约15DP），其催化作用更容易。JaMan5A和BGM“Amano”10在两种基质中表现相同。相比之下，SlMan5A对象牙坚果甘露聚糖和1,4-β-D-甘露聚糖的比活性最高，分别为362±29和645±25 U/mg蛋白质。这些活性分别比活性第二高的GH26内切-1,4-β-甘露聚糖酶高出约30%和40%。EgMan5A是两种底物中活性最低的酶。

表4. 内切-1,4-β-甘露聚糖酶EgMan5A、JaMan5A和SlMan5A与两种市售β-甘露聚糖酶的底物特异性（U/mg蛋白质）比较。

一些研究报告了对象牙坚果甘露聚糖的特异性活性，例如Lima等人，他们从桔青霉中产生了一种β-甘露聚糖酶，对象牙坚果甘聚糖的特异活性为62 U/mg。此外，另一项研究报告了一种真菌β-甘露聚糖酶的低比活性（2.7 U/mg），推测低活性是由于象牙坚果甘露聚糖的结晶度造成的。因此，这项针对线性甘露聚糖的酶活性研究的结果与了解酶对这些底物的特异性高度相关，而这些底物的研究要少得多。

在表达的酶中，只有EgMan5A对刺槐豆和魔芋胶表现出特异性活性，而JaMan5A和SlMan5A在测定期间对这些底物没有催化活性（表4）。GH26β-甘露聚糖酶对这些牙龈的比活性最高，而EgMan5A的比活性最低。同样，一项关于拟南芥β-甘露聚糖酶的研究报告称，对所有测试的底物的比活性都很低，而真菌β-甘露聚糖酶在文献中对刺槐豆和魔芋胶显示出广泛的活性。例如，构巢曲霉β-甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖的比活性为184.8 U/mg，而双孢霉β-甘露聚糖酶的活性为3373 U/mg。

与其他底物相比，阿萨伊种子的比活性显著降低。这可能是因为，与纯β-甘露聚糖的其他基质不同，整个阿萨伊种子都是通过碾磨加工的，不仅包含胚乳，还包含其他成分作为外皮。与其他基材相比，这种混合物引入了更高的复杂性（表4）。同样，Pangsri等人在测试β-甘露聚糖酶对不同β-甘露聚糖底物的比活性时发现，酶对脱脂椰干粉的比活性比魔芋胶低20倍。尽管绝对值较低，SlMan5A对阿萨伊种子显示出最高的比活性，表明与其他酶相比，对açi种子线性甘露聚糖的特异性更高，这也可能与其更高的热稳定性有关。这与它对象牙坚果甘露聚糖和1,4-β-D-甘露聚糖的高特异性是一致的。据我们所知，没有研究报告酶对未经处理的阿萨伊种子的特异性活性。然而，最近的一项研究报告称，使用RohalaseGMP酶（AB酶）24小时后酶水解的产率为10%。另一项研究还报告称，使用BGM“Amano”10在72小时后水解未经处理的阿萨伊种子时，产量较低（低于3%）。

因此，我们使用之前在阿萨伊发芽过程中蛋白质组动力学研究中鉴定的内切β-甘露聚糖酶之一作为参考的策略成功地捕获了对线性甘露聚糖具有高特异性的真菌酶。然而，植物内切β-甘露聚糖酶对不同的β-甘露聚糖底物表现出更广泛的作用（表4）。鉴于这些差异可归因于酶催化位点的细微变化，我们继续研究催化结构域的结构模型。

4.EgMan5A、JaMan5A和SlMan5A结构建模

生成EgMan5A、JaMan5A和SlMan5A的AlphaFold2结构模型。通过与Solanum lycopersicum内切-1,4-β-甘露聚糖酶（1RH9）的PDB结构叠加，预测EgMan5A活性位点和亚位点的氨基酸残基，而JaMan5A和SlMan5A的活性位点和亚位点的氨基酸残基通过米黑根毛霉（4QP0）的PDB结构预测。此外，分析了三种表达的内切-1,4-β-甘露聚糖酶与具有PBD数据库中可用结构的所有GH5内切1,4-β-甘露聚糖酶序列之间的蛋白质序列比对。

通过叠加分析，EgMan5A的活动位点与Solanum lycopersicum（1RH9）的模型非常吻合（图3）。早期的一项研究预测了1RH9催化活性位点中存在的氨基酸残基，该研究使用甘露五糖作为底物。EgMan5A几乎显示了1RH9位点中的所有残基，除了两个残基，一个位于+1亚位点的Trp-135，在EgMan5A中被Tyr-109取代，另一个位于-3亚位点的Ser-369被Asn-337取代（图3A）。

图3. 存在于（A）EgMan5A、（B）JaMan5A和（C）SlMan5A活性位点中的氨基酸残基。EgMan5A（绿色）的活性位点和亚位点位置是通过与番茄茄内切-1,4-β-甘露聚糖酶（1RH9）（黑色）（氨基酸名称为黑色）的PDB结构叠加来预测的（红色氨基酸名称），而JaMan5A（黄色）和SlMan5A（紫色）（红色氨基酸名）的活性位和亚位点是通过使用米氏根毛霉内切-1,4β-甘露聚糖酶（4QP0）（粉色）（黑色氨基酸名称）的PDB架构来预测的。黑框表示在活动位点叠加中发现的差异。

丝氨酸被天冬酰胺取代不改变催化裂解的反应，因为这两种氨基酸都是极性的，不带电荷。此外，比对分析表明，该区域（位置343）在比对的β-甘露聚糖酶序列中并不保守。相比之下，色氨酸向酪氨酸的变化涉及更显著的差异。虽然两者都是芳香族氨基酸，但酪氨酸的羟基赋予了更高的极性，而色氨酸由于其侧链中的吲哚环而更疏水且体积更大。此外，Trp-135是GH5_7β-甘露聚糖酶中的一个保守氨基酸，位于比对中的第109位。这种变化可能会影响这种酶的整体效率或特异性。事实上，在比较动力学和酶活性的结果时，EgMan5A是效率最低的酶（表3和表4）。然而，从Trp到Tyr的变化并不总是影响催化性能，这种变化的影响应该通过实验来评估。例如，一项关于具有保守Trp到Tyr取代的α-1,3半乳糖基转移酶突变形式的研究发现，其整体结构和水解酶活性没有差异，但确实影响了转移酶的效率。此外，EgMan5A更广泛的底物特异性可能与降解或改变在种子发育和发芽的不同阶段储存的不同类型的β-甘露聚糖，如咖啡豆发育中所报道的。

当与4QP0叠加时，JaMan5A和SlMan5A的大多数活性位点残基在空间位置上完全一致，除了SlMan5A中的Tyr-114被苯丙氨酸取代，以及JaMan5A与SlMan5A都没有4QP0中的Asp-334（图3B，C）。事实上，在比对中，346位对应于具有可用PDB结构的GH5_7β-甘露聚糖酶中的天冬氨酸残基，而JaMan5A和SlMa5A在该位置有一个丝氨酸。此外，当比较Asp-334与真菌GH5_7β-甘露聚糖酶结构的叠加时，该氨基酸的保守位置是显而易见的。相比之下，JaMan5A（Ser-386）和SlMan5A（Ser-381）的丝氨酸残基位于不同的位置，甚至可能不在催化间隙中。

有趣的是，JaMan5A和SlMan5A对刺槐豆和魔芋胶没有表现出水解活性（表4）。进一步讨论了这些酶对半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖缺乏活性的问题。在之前的一项研究中，简要讨论了天冬氨酸残基在该位置的作用，其中GH5β-甘露聚糖酶的结构叠加在GH5内切葡聚糖酶结构上。有人认为，这种残留物可能与甘露糖和细胞三糖选择性的差异有关。EgMan5A（Asp-372）的活性位点也发现了−2亚位点中的天冬氨酸残留，EgMan5A也能水解刺槐豆和魔芋胶（图3A；表4）。此外，GH5_7真菌β-甘露聚糖酶的六种结构（4QP0、4AWE、3ZIZ、3WFL、1QNO和3WH9）在该位置都有一个保守的天冬氨酸，据报道，它们都能水解半乳甘露聚糖和/或葡甘露聚糖。此外，一项研究调查了GH26β-甘露聚糖酶的特异性及其与催化亚基突变的相关性，发现亚基-2和-1主要负责这些酶中半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖的特异性。因此，在JaMan5A和SlMan5A的-2区域观察到的差异可能与它们在刺槐豆和魔芋胶中缺乏水解活性有关。

SlMan5A在水解1,4-β-D-甘露聚糖、象牙坚果β-甘露聚糖和阿萨伊种子方面表现出高度的特异性，这可能是由于其较高的最适温度。分子对接揭示了其活性位点内的不同相互作用，包括Asn-145、Tyr-388、His-297和Thr-303（图4）。虽然其优越的热稳定性可以解释水解性能的增强，但观察到的活性位点的变化表明，潜在的氨基酸参与了线性β-甘露聚糖的特异性。需要进一步调查以证实这些发现。

图4. SlMan5A的活性位点。通过与甘露糖（黄色棒）对接预测相互作用。氢键相互作用以品红色虚线表示。

03

结论

DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c07018