1.1 过氧化氢酶提取工艺的优化
表S1（a）提供了酶活性值，包括实验值和预测值，以及相应的系数，图S1给出了可视化表示。在这些数据中，在pH为7.5的50 mmol/L磷酸盐缓冲液中，样品与缓冲液的比例为1:7.5时，观察到过氧化氢酶活性峰值为346 U/mL。
变量pH、缓冲液浓度和样品缓冲液比分别表示为A、B和C。该模型的功效由较高的R2值（0.9089）和与酶活性相关的调整后的R2（0.8270）来证明。表S1（b）列出了与这些因素相对应的系数值。在我们之前的研究中，过氧化氢酶是直接从葵花籽中提取的，而不需要经过丙酮粉末制备。使用pH 7.8的1 mol/L磷酸盐缓冲液和1:5（w/v）的比例进行冷提取，酶活性为245.2±22.25 U/mL。值得注意的是，目前的研究表明过氧化氢酶活性显著提高了1.4倍，达到346 U/mL。与我们之前的发现相比，这一改进是通过采用响应面法（RSM）实现的，强调了其在优化酶提取过程中的有效性。
表S1.（a）实验值和预测值响应（b）方差分析![]()
![]()
图S1.显示（A）缓冲液pH和浓度（B）缓冲液浓度和比率（w/v）以及（C）pH和比率（w/w）之间相互作用的图通过模型响应过氧化氢酶活性确定为响应面。
过氧化氢酶提取涉及初始丙酮步骤，随后是硫酸铵分级，然后通过DE-52纤维素阴离子交换柱透析进行部分纯化。随后，来自DE-52纤维素柱的过氧化氢酶活性组分通过Sephadex G-150柱进行额外纯化。令人印象深刻的是，这一过程使过氧化氢酶活性大幅提高了6.55倍。经过DE-52纤维素柱纯化后，比活产率为28.91，蛋白质含量为2000 U/mg。通过Sephadex G-150柱纯化后，过氧化氢酶活性显著提高了25.25倍，最终比活性为7714.29 U/mg蛋白。为了测定纯化过氧化氢酶的分子量，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。考马斯染色后，可以清楚地看到一条单一的蛋白质带，表明过氧化氢酶的分子量为57.8kDa。另一项先前的研究表明了，网状叶下珠（51.3 kDa）、马蹄莲（54 kDa）和发芽南瓜子叶（55 kDa）叶片中过氧化氢酶的分子量。在本研究中，使用甲壳素、HA和壳聚糖以及HA甲壳素和HA壳聚糖的杂化组合固定纯化的过氧化氢酶。所选的固定化方法涉及吸附，随后，利用戊二醛对固定化酶进行交联。采用酶固定化技术的主要目的是提高酶的稳定性和可重复使用的潜力。通过采用这些固定化方法，该研究旨在优化过氧化氢酶的功能，从而提高其耐用性，使其更易于重复使用。这对酶稳定性和可重复使用性至关重要的实际应用具有重要意义。所达到的稳定程度受到载体材料性质、所选固定化技术和酶固有结构特征的影响。在这项研究中，过氧化氢酶的固定化是使用甲壳素、透明质酸和壳聚糖进行的，这三种天然物质以其稳定性而闻名。这些材料中的每一种都充当了固定过氧化氢酶的可靠支架。通过评估pH值和吸附过程的持续时间，确定了过氧化氢酶在这些不同载体上吸附的最佳条件。不同载体的理想条件各不相同：甲壳素24小时，壳聚糖4小时，HA 20小时，HA甲壳素24小时，HA壳聚糖8小时。这些发现通过在不同时间测量酶活性，确定了实现过氧化氢酶在每种载体材料上最佳吸附的最有效时间框架，这对于确保有效的固定和随后的酶稳定性至关重要。过氧化氢酶在甲壳质、HA、壳聚糖、HA甲壳素和HA壳聚糖上吸附后，用戊二醛交联。戊二醛可以与酶分子和载体中存在的氨基或羧基反应，随后形成分子内和分子间的连接，吸附接触得到加强，酶的稳定性随着时间的推移而提高。根据目前的结果，表1显示交联法的方法比共轭法的方法更合适、更有效。![]()
表1.使用交联和共轭方法回收过氧化氢酶-甲壳素、过氧化氢酶-壳聚糖、过氧化氢酶-HA、过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶-HA/壳聚糖的活性（%）。数据以平均值±标准误差表示。交联法与共轭法的比较（单因素方差分析，然后进行Tukey后验）。
先前的研究表明，化学交联是利用聚合物链之间的共价键产生永久水凝胶网络的最直接方法。壳聚糖上可用的-NH2和-OH基团是能够形成多种连接的活性位点，包括酰胺和酯键以及席夫碱的形成。这些网络可以通过使用小分子交联剂、活化官能团之间的聚合物-聚合物反应、光敏剂和酶催化反应形成。在本研究中，我们利用HA/甲壳素和HA/壳聚糖作为支撑材料，这些材料具有固有的稳定性和环境相容性。经过仔细考虑，我们选择了涉及HA/甲壳素和HA/壳聚糖配置的交联方法。这一选择是固定化技术的代表性样本，为后续研究做好了准备。值得注意的是，这一选择受到了HA/甲壳素和HA/壳聚糖在测试变异中表现出最高可回收活性的事实的影响，突显了它们进一步综合研究的潜力。我们研究了4℃下交联时间对过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖活性的影响。由于结合不足，2小时的交联显示出最低的活性，导致聚集不均和酶泄漏。延长持续时间可以改善活动，在6小时达到峰值，表明稳定性提高。随后，活性下降，可能是由于长期接触戊二醛造成的不良联系。过度交联会损害酶的灵活性，强调了平衡交联以获得最佳固定条件的必要性。该研究深入探讨了不同GA浓度对过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖最佳活性的影响，范围在50-150mmol/L。值得注意的是，在GA浓度为100mmol/L时，观察到最明显的恢复活性。使用低GA浓度进行交联产生了不令人满意的结果，主要归因于结合效果不足。相反，过高的GA浓度会导致酶的灵活性受损。这一结果源于酶活性位点发生的不希望的结合相互作用，以及酶分子之间过度连接的形成。这些条件共同导致酶活性水平降低。因此，保持统一的GA浓度成为关键考虑因素。这种做法确保了有效的交联，同时保护了酶的固有功能属性。图S2生动地说明了将不同量的HA作为共进料的有利影响。值得注意的是，HA的加入显著提高了酶的活性。当引入HA作为补充剂时，过氧化氢酶HA/甲壳素的过氧化氢酶活性恢复率达到79.00%，过氧化氢酶HA/壳聚糖的过氧化氢酶活力恢复率达到88.50%。与未掺入HA时观察到的63.0%相比，这些值显著增加。这种改善可归因于更多表面氨基（Trp、Tyr和Phe）的存在，这可能有助于增强固定化过氧化氢酶和HA之间的相互作用，从而提高酶活性的恢复。这增强了与HA的相互作用，从而提高了活动恢复。经过综合分析，确定了所考察变量的最佳条件。发现这些是100 mmol/L GA浓度、6小时交联期和添加15 mg HA作为共饲养剂。这些特定参数导致了最高的酶活性恢复，对于实现优化的过氧化氢酶固定化至关重要。![]()
图S2.沉淀剂种类（A）交联时间、（B）GA浓度、（C）、HA量对过氧化氢酶@HA/甲壳素和过氧化氢酶@HA/壳聚糖每个实验进行三次。如图1所示，SEM分析深入研究了使用共轭法在各种载体上固定过氧化氢酶时的结构特征。研究结果表明，固定化过氧化氢酶在不同载体材料上的结构排列是一致和直接的。这些SEM观察证实了固定化过氧化氢酶在相应模板表面上的预期放置。SEM图像作为视觉证据，证实过氧化氢酶成功固定在所选载体上。如图1（A和B）所示，过氧化氢酶-甲壳素和过氧化氢酶-壳聚糖样品显示出不规则的大小和形状，形成了一个有纹理和多孔的表面。值得注意的是，与过氧化氢酶甲壳素相比，过氧化氢酶-壳聚糖复合物（图1B）的形状不规则，孔隙增加。相反，如图1C所示，过氧化氢酶HA复合物表现出更光滑的平面纹理。过氧化氢酶-HA/甲壳素和过氧化氢酶-HA/壳聚糖复合材料的表面更光滑，表明酶负载在表面和孔中，见图1（D和E）。SEM分析强调，使用HA增强了复合材料的整体光滑和平面纹理。![]()
图1.过氧化氢酶-甲壳素（A）、过氧化氢酶-壳聚糖（B）、过氧化氢蛋白酶-HA（C）、过氧化氢酶-HA/甲壳素（D）和过氧化氢酶-HA/壳聚糖（E）的SEM图像。图像的比例尺为20μm。如图2所示，光谱中存在的独特峰清楚地表明，通过共轭法成功固定了过氧化氢酶。使用傅里叶变换红外光谱技术可以鉴定和表征化合物中的化学键和官能团。过氧化氢酶-壳聚糖和过氧化氢酶HA/壳聚糖光谱图2显示了分别由自由轴向羟基（OH）、仲胺和伯胺拉伸振动引起的（3266-3272 cm-1）、（1638-1646 cm-1）和1546-1547 cm-1）附近的峰，表明这些官能团参与了固定化过程。值得注意的是，这些相互作用对固定化过氧化氢酶的氢键或构象的影响，有助于过氧化氢酶-甲壳素光谱的独特性，过氧化氢酶-甲壳素光谱中3150 cm-1附近的峰值是由于-OH伸缩振动造成的，其中过氧化氢酶-几丁质光谱中3295 cm-1的宽带是由于NH基团的不对称和对称伸缩造成的。在2927 cm-1处出现的峰属于不规则和规则的C-H振动拉伸。红外光谱（图2）显示，在（1634-1639 cm-1）附近有一个峰值，对应于过氧化氢酶甲壳素和过氧化氢酶HA/甲壳素光谱中甲壳素N-H拉伸的强吸收带。提供信息的峰带区域属于995 cm-1，对应于C=O键。1539 cm-1和1375 cm-1处的特征峰分别表示CH2的摆动和CH2和CH峰的弯曲振动。![]()
图2.过氧化氢酶-甲壳素、过氧化氢酶-壳聚糖、过氧化氢酶-HA、过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶-HA/壳聚糖的FTIR光谱。当HA与甲壳素混合时，甲壳素和HA之间可能形成酰胺键，这可以从酰胺I和II带约1634 cm-1和1545 cm-1的吸收带中识别出来。过氧化氢酶HA/甲壳素的FTIR光谱显示了透明质酸和甲壳素特征的独特组合。将这些特征与过氧化氢酶HA和过氧化氢酶甲壳素的单独光谱进行比较，可以阐明透明质酸和甲壳素在支持过氧化氢酶固定化方面的协同作用和相互作用。了解光谱变化，特别是乙酰基和羰基延伸的光谱变化，为透明质酸、甲壳素和壳聚糖在支持过氧化氢酶固定化方面的协同作用提供了有价值的信息。傅里叶变换红外光谱还显示，1634-1646 cm-1和1539-1547 cm-1的峰分别归属于与肽的C-O伸缩振动相关的酰胺I带和由蛋白质结构的N-H弯曲和C-N伸缩引起的酰胺II带，这证实了酶的固定化。总之，对每种化合物的FTIR光谱进行详细比较，并强调观察到的独特特征和变化，有助于全面了解固定化过程以及过氧化氢酶与相应载体材料之间的相互作用。1.5.3. 通过TGA对制备的样品进行热稳定性分析通过TGA分析评估了所有制备样品的热稳定性，如图3。过氧化氢酶-甲壳素和过氧化氢酶-壳聚糖的TGA曲线呈现出平行趋势。在190-250℃的温度范围内，两个样品的重量分别减轻了约30%和35%。这种重量减轻可归因于从固定化酶中去除溶剂分子。当温度升至600℃时，两个样品的重量损失均扩大到55%，这表明样品中的有机分子发生了分解。![]()
图3.过氧化氢酶-甲壳素、过氧化氢酶-壳聚糖、过氧化氢酶-HA、过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶-HA/壳聚糖的TGA曲线（A）、Zeta电位曲线（B）。过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖的TGA曲线的比较揭示了几乎相同的行为。在25-300℃的温度范围内，由于H2O分子的消除，发生了大约10%的轻微重量损失。在高温下，过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖的重量损失显著增加，在600℃和900℃时分别达到40%和68%。这些重量损失与过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖结构的降解以及样品中有机成分的去除有关。相反，当检查过氧化氢酶HA与其他化合物的TGA曲线时，出现了明显的区别。TGA结果显示，在25至100℃之间，由于吸附溶剂的消除，重量逐渐减轻了20%。在100-200℃的温度范围内，重量减轻归因于过氧化氢酶HA的部分分解，见图3A。此外，过氧化氢酶HA的分解在200至400℃之间展开，导致重量减轻约40%。在400-800℃范围内出现炭渣也可能是由于样品中有机分子的分解。Zeta电位是一个关键指标，反映了控制颗粒相互作用的静电力，并显著影响分散体、乳液和悬浮液的稳定性。对zeta电位测量的详细检查为分散、聚集和絮凝的动力学提供了有价值的见解，有助于增强配方。在酶固定化的背景下，zeta电位是解开酶与其支撑结构之间静电相互作用的关键工具。当涉及带相反电荷的表面时，这一见解变得尤为重要，会影响固定化过程中的结合效率。酶和载体的zeta电位，特别是pH值，在固定化过程中至关重要。了解这些静电细微差别变得至关重要，因为它们会影响酶与其支持物之间的结合效率。仔细考虑整个固定化过程中zeta电位的变化，可以揭示有效酶结合的最佳条件。图3B显示了游离过氧化氢酶和各种过氧化氢酶载体化合物在pH值4.0-12.0范围内的zeta电位值。这些值在理解固定化机制方面起着至关重要的作用，特别是酶的等电点和化合物的零电荷点。值得注意的是，过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖在pH值4.0至12.0的范围内表现出高度负的zeta电位值（分别为-30.0 mV和-32.80 mV），表明表面带负电荷。一般来说，HA/壳聚糖和HA/甲壳素的表面电荷比其他样品更负。NH4+离子作为沉淀剂加入过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖中，提高了固定化程度。更高的负zeta电位通常意味着更强的静电排斥，可能促进酶与带正电的表面结合，并有助于酶-支持物相互作用的稳定性。此外，疏水性和弱范德华相互作用可能在改善酶与载体结合方面发挥了作用。这种全面的zeta电位分析为所研究化合物的相互作用动力学和固定化机制提供了有价值的见解。
1.5.5 pH值和温度的影响
如图4A所示，在不同pH值下评估了游离和固定形式的过氧化氢酶活性。研究结果强调了每种形式的不同最佳pH点：游离酶的pH值为7，固定化酶的pH为7.5。最佳pH值的这些偏差可能是由于酶和聚合物载体之间发生的二次相互作用造成的。这些相互作用包括氢键、极性相互作用和离子相互作用等现象，所有这些都可能导致观察到的游离和固定化酶形式之间pH敏感性的变化。研究结果表明，与其他过氧化氢酶固定方法相比，使用过氧化氢酶HA/壳聚糖方法固定的过氧化氢酶表现出更明显的活性。如图4B所示，通过将酶置于20至60℃的温度范围内，研究了温度的影响。对于过氧化氢酶HA/壳聚糖，最佳温度分别为40℃。相比之下，其他固定化过氧化氢酶形式的最佳温度为35℃。值得注意的是，对于游离过氧化氢酶，反应速率在25至30℃之间增加，随后在较高温度下迅速降低。此外，在最佳温度以上，固定化过氧化氢酶的活性损失速度明显低于游离过氧化氢酶。这种行为可能归因于酶和支持材料之间的疏水相互作用，这可能会影响酶的运动和活性。这些观察结果共同表明，固定化有助于提高过氧化氢酶的稳定性。最佳温度的改变和高于最佳温度时的行为改变强调了固定化对酶催化行为和热稳定性的影响。![]()
图4.（A） 游离过氧化氢酶、甲壳素过氧化氢酶、壳聚糖过氧化氢酶、过氧化氢酶-HA、过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶-HA/壳聚糖的pH相对活性的影响（%）和（B）温度相对活性的影响（%）。
操作稳定性与可重复使用性有关，是酶在工业应用中效用的关键方面。图5A显示了对固定化过氧化氢酶进行的25个循环的可重复使用性测试的结果。值得注意的是，过氧化氢酶HA/甲壳素的相对活性为73.80%，过氧化氢酶HA/壳聚糖为79.55%。之前的一项研究表明，在20个循环后，聚（N-异丙基丙烯酰胺）上固定化过氧化氢酶的活性为15%。![]()
图5.（A） 游离过氧化氢酶、过氧化氢酶甲壳素、过氧化氢酶壳聚糖、过氧化氢酶HA、过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖的操作稳定性相对活性（%）和（B）储存稳定性相对活性（%）。表2显示，10次循环后，通过吸附法将过氧化氢酶固定在壳聚糖/ZnO和壳聚糖/ZnO/Fe2O3中的比例分别为14%和45%。另一项研究表明，使用戊二醛交联剂将过氧化氢酶固定在CLEA淀粉中，5个循环后固定率为40%。包裹在整体式聚两性电解质冷冻凝胶中的过氧化氢酶显示，在连续五次运行中，乙醇转化为乙醛的转化率没有显著降低，第五次运行后为57.3%。20次循环后，壳聚糖珠和壳聚糖-膨润土复合珠上剩余的固定化过氧化氢酶活性分别为70%和50%，见表2。这些结果可以用酶变性产生的酶失活来解释。其他作者还发现，在pH 6.0至8.0的范围内，固定化后过氧化氢酶的活性保持在原始活性的80%以上。表2.本文和其他研究中固定化过氧化氢酶的性质比较。![]()
图5B提供了酶储存稳定性的见解。在评估过程中，游离过氧化氢酶和固定化过氧化氢酶都储存在4℃下，前者储存在pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，后者储存在pH 7.5的0.5 mmol/L的磷酸盐缓冲溶液中。图5B中观察到的趋势表明，游离和固定化的过氧化氢酶的活性下降明显慢于游离过氧化氢酶。60天后，对酶的活性进行了评估，结果表明，游离过氧化氢酶、过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖分别保留了原始酶活性的10%、68%和72%。在游离酶和壳聚糖、壳聚糖-膨润土珠固定的情况下，60天后的储存稳定性分别为其原始活性的22%、60%和70%。通过Michael受体膜涂层将过氧化氢酶固定在二氧化硅颗粒上，表明酶反应器在30℃下可以连续运行120小时，仅损失约36%的初始活性。值得注意的是，相比之下，固定化形式表现出更高的稳定性，特别是过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖。这些发现强调了酶固定化在储存期间保持过氧化氢酶活性方面的显著优势，这对于需要长时间持续酶活性的实际应用来说是一个至关重要的考虑因素。
1.5.7 动力学参数
米氏动力学模型用于估算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。从网纹叶下珠中提取的游离过氧化氢酶Km值为3.18 mmol/L，而过氧化氢酶Km值为0.74*10−5 mol/L。纯化过氧化氢酶的Vmax为5.32 U/mg样品。
结果表明，与游离过氧化氢酶相比，固定化增加了Vmax值，见表2。Vmax值随着固定化而增加，因此单位时间内有更多的底物转化为产物。此外，定义为催化效率的固定化酶的比率（Vmax/Km）高于游离酶（表3）。使用与游离过氧化氢酶和其他固定化过氧化氢酶高度相关的壳聚糖HA和壳聚糖HA固定化的过氧化氢酶的Vmax/Km。这些结果可以用这样一个事实来解释，即由于固定化使过氧化氢酶分子在甲壳质HA和壳聚糖HA表面膨胀，酶活性位点更容易接近。甲壳素HA和壳聚糖HA的动力学参数值的差异是由于它们的制备条件不同(见表3)。
表3. 游离过氧化氢酶、过氧化氢酶甲壳素、过氧化氢酶壳聚糖、过氧化氢酶HA、过氧化氢酶HA/甲壳素和ncatalase HA/壳聚糖的动力学参数。数据以平均值±标准误差表示。与游离过氧化氢酶相比（单因素方差分析，然后进行Tukey后验）。![]()
1.5.8 半衰期和热稳定性
失活常数（Kd）由图表的斜率得出，并计算了所有温度下的相应t1/2值，如表4所示。研究结果明确强调，与游离过氧化氢酶相比，将过氧化氢酶固定在HA/甲壳素和HA/壳聚糖底物上具有更大的稳定性，t1/2值证明了这一点。具体而言，游离过氧化氢酶的最大t1/2值在30℃时记录。相反，过氧化氢酶在HA/壳聚糖上的固定化最高t1/2值是在40℃时达到的。这项研究强调，40°C至50°C之间的温度范围特别有利于使用活性损失最小的固定化过氧化氢酶，正如50°C时相对较高的t1/2值与60°C相比所表明的那样。重要的是要注意，在60°C时，游离过氧化氢酶经历了变性，这是酶结构的不可逆破坏，导致其功能失活。这强调了酶固定化在高温下保持酶活性的优势，使其成为各种工业应用的宝贵资产。
表4.游离过氧化氢酶、过氧化氢酶甲壳素、过氧化氢酶壳聚糖、过氧化氢酶HA、过氧化氢酶HA/甲壳素和过氧化氢酶HA/壳聚糖的失活常数（Kd）和半衰期（t1/2）。![]()
