《Nature Communications》人类肠道微生物表达功能不同的内切糖苷酶，以代谢相同的N-聚糖底物

2024年6月，Diego E. Sastre等人在Nature Communications上发表了一篇名为Human gut microbes express functionallydistinct endoglycosidases to metabolize thesame N-glycan substrate的研究性论文。

拟杆菌thetaiotaomicron编码两种高甘露糖聚糖特异性内切糖苷酶

为了定义ENGases GH18家族内的序列结构-功能关系并预测底物特异性，我们对CAZy数据库中包含的所有GH18家族成员（53000多个序列）进行了序列相似性网络（SSN）分析。我们发现，来自流行的人类肠道细菌B.thetaiotaomicron VPI-5482菌株的ENGases GH18家族（EC 3.2.1.96）可分为四个亚组或簇，仅包含拟杆菌门衍生的酶，比对得分阈值为50（图1a）。其中两个簇中的蛋白质（簇1（C1）和4（C4）；分别由77个和4个开放阅读框（ORF）组成）包含一个名为DUF4849的未知功能域，并包括C1中的B.thetaiotaomicron GH18推定的ENGases BT1038、BT1044、BT1048、BT3753、BT4406，以及C4中的BT4709。另外两个簇（C2和C3；分别由176个和18个ORF组成）缺少这个结构域，包括C2中的BT3987和C3中的BT1285。所有这些蛋白质都被预测会表现出GH18催化结构域的典型（β/α）₈-或TIM桶折叠，这得到了同源物的晶体结构或Alphafold2结构预测的支持。含有DUF4849（PF16141）的C1和C4成员先前已被证明参与复杂型（CT）N-聚糖分解代谢11）；C2中的那些，包括EndoF1、EndoH和BT3987，能够特异性地加工HM Nglycans，C3的成员，包括BT1285，与其他簇相比，与簇C2显示出更高的序列相似性。BT1285和BT3987编码在两个不同的PUL中：PUL16包含编码BT1278至BT1285蛋白的基因；而PUL72含有编码BT3983至BT3988蛋白的基因（图1b）。这些PUL中基因产物的表达分别受独立的细胞外sigma因子和抗sigma因子的调节，并含有SusC和SusD样蛋白（图1b）。图1.拟杆菌thetaiotaomicron编码两种高甘露糖聚糖特异性内切糖苷酶。a. CAZY数据库中GH18家族的序列相似性网络，比对得分阈值为50，代表10984个蛋白质节点。b. B.thetaiotaomicron的PUL16和PUL72的示意图。ECFσ，胞浆外σ因子；SGBP，表面聚糖结合蛋白；未知功能的蛋白质。指示了同源基因之间蛋白质序列同一性的百分比。c. 在四种不同糖蛋白底物（每种2µM）存在下，对BT3987（50 nM）和BT1285（50 nM）进行竞争动力学分析。分析技术重复三份（n=3）。曲线表示完全去糖基化底物比例。d. B.thetaiotaomicron中HM特异性PUL的示意图，表明PUL 16和72的蛋白质组分的预测亚细胞定位。从AF模型中获得蛋白质结构的卡通表示，但BT3984（pdb:8UWV）、BT3984、BT3990（pdb:2WVX）和BT1281（pdb:4MRU）除外。糖符号： 蓝色：GlcNAc、绿色：Man、红色：Fuc、黄色：Gal、紫色：Neu5A。

为了进一步研究在PUL16和PUL72中发现的GH18家族成员的活性和底物特异性，我们使用四种不同底物的混合物进行了酶活性与动力学竞争特异性（C-SEAK）测定：（1）IgG1的Fc区，含有连接到两种原聚体Asn297的CT N-聚糖；（2）RNAseB，一种内核糖核酸酶，在N34处具有一个单一的N-连接糖基化位点，携带HM N-聚糖（主要是HM聚糖Man₅和Man₆）；（3）转铁蛋白，一种含有唾液酸化双天线和三天线CT N-聚糖的蛋白质；以及（4）在Asn297处携带Man₈和Man₉的单克隆IgG1抗体（利妥昔单抗）-HM。在图1c所示的动力学分析中，我们发现BT1285和BT3987只处理附着在RNAseB和IgG底物上的HM N-聚糖，而不处理转铁蛋白和IgG上的CT N-聚糖，这证实了它们是HM特异性的GH18 ENGase。此外，我们观察到BT1285在RNAseB水解方面与BT3987相当，但在IgG-HM水解方面比BT3987快近20倍（图1c）。因此，BT1285和BT3987都可能位于外膜的外小叶，协同特异性代谢HM N-聚糖并将其导入B.thetaiotaomicron细胞（图1d）。

我们发现PUL16还编码另一种推测的GH18内切糖苷酶变体BT1284。然而，这种蛋白质在催化位点上包含两个酸性残基的非保守取代，因此缺乏真正ENGases的典型催化DGxxxDxE基序。我们在几个拟杆菌属物种中发现了与BT1284同源的ENGase样蛋白（至少20个不同物种中有85个序列），具有类似的催化和底物结合位点残基替换。通过使用复合型聚糖（来自动物和植物来源）和HM N-聚糖作为底物的酶活性测量，我们证实BT1284和一种来自屎拟杆菌的直系同源物（Uniprot ID:A0A6HOKHH8）确实受到了催化损伤，我们将其命名为B. faecium GH18-like。BT1284和整个拟杆菌属物种中其他GH18样蛋白的ENGase活性受损，与几丁质酶活性受损的GH18样蛋白质相似，其中一些已知作为凝集素发挥作用，在植物和人类的生理学中起着关键作用。我们还通过SPR分析评估了BT1284的HM N-聚糖结合能力。然而，我们没有观察到BT1284与HM N-聚糖底物（RNAseB和IgG-HM）的可测量结合。为了更好地了解它们缺乏催化活性和聚糖结合能力，我们确定了B. faecium GH18的X射线晶体结构，最高分辨率为2.67Å。通过使用DALI服务器48和FoldSeek49，我们发现B. faecium GH18最接近的结构同源物是BT3987（435个残基中2.9Å的均方根偏差（RMSD），19%ID）、EndoH（23%ID）和EndoF1（18%ID），所有HM特异性ENGase。B. faecium GH18的晶体结构揭示了存在一个TIM桶形折叠，这是GH18家族ENGase的典型特征，与BT3987相似，融合到N末端区域的β三明治结构域（DUF1735），以及GH18酶共有的β-发夹基序，对HM N-聚糖具有特异性。对这种ENGase样蛋白的推定聚糖结合袋的结构表面分析表明，HM N-聚糖不适合真正的HM内切糖苷酶。总之，这些数据表明，在所测定的条件下，ENGase（GH18）样蛋白无法水解或结合N-聚糖，但它们可能仍然通过一些尚未确定的机制在拟杆菌的HM PUL中的N-聚糖代谢中发挥作用。

BT1285 HM N-聚糖底物特异性的结构基础

为了确定与之前描述的对应物BT3987相比，发现的HM加工GH18 ENGase BT1285识别和水解N-聚糖的机制，我们首先以1.08Å的分辨率确定了BT1285的X射线晶体结构。BT1285显示了在其他GH18家族成员中发现的典型（β/α）8-barrel催化结构域。通过使用DALI服务器和FoldSeek，我们发现最接近的结构同源物是EndoH（PDB代码1c8y；Z分数，37.2；253个对齐残基的r.m.s.d为1.3Å；36%同一性）和BT3987（Z分数，31.7；263个残基的m.m.s.d.为2.4Å；29%同一性。为了更好地理解BT1285特异性水解N-聚糖的分子机制，我们以1.9Å的分辨率解决了BT1285催化无活性变体（BT1285_D161A-E163A；以下简称BT1285i）与Man₉GlcNAc₂底物复合物的晶体结构（图2a-d）。我们发现Man₉GlcNAc₂底物的一个分子明确地位于酶的活性位点，两侧有以下连接区域：β1-α1（环1；残基52-57），β2-α2（β发夹；残基78-94），β4-α3（环2；残基123-135），β5-α4（环3；残基161-178），β6-β7（环4；残基199-204），β7-β8（环5；残基218-240），β8-α5（环6；残基243-250），β9-α6（环7；残基272-282）（图2a、c、d）。图2.BT1285 HM N-聚糖底物特异性的结构基础。a. BT1285_D161A-E163A（BT1285i）与Man₉GlcNAc₂（pdb代码：8U48）配合物晶体结构的表面表示。HM N-聚糖周围的不同GH环有明显的颜色。b. BT1285i（黄色）和BT3987_D312A-E314L（BT3987i）（紫色）叠加晶体结构的两个卡通表示图（pdb代码：6TCV，均与Man₉GlcNAc₂复合。c. BT1285_D161AE163A-Man₉GlcNAc₂晶体结构的Man₉Glc NAc₂衬底的电子密度图的两个视图，显示偏差为1.0σr.m.s。左侧为Man9GlcNAc2基板的示意图。糖符号：蓝色：GlcNAc，绿色：Man。被ENGases切割的β-1-4键用剪刀表示。d.密切检查BT1285与Man₉GlcNAc₂复合物中的底物结合位点。丙氨酸扫描分析中使用的残留物以棒状表示。e. 通过LC-MS分析测定的BT1285和突变体对HM-IgG1的水解活性，归一化为BT1285 wt。数据以平均值±SD表示。分析技术重复三份（n=3）。f. 仔细检查BT1285中甘露糖识别和结合所涉及的关键残留物。

我们观察到BT1285的未结合和聚糖结合形式的蛋白质骨架没有实质性的构象变化（271个残基的r.m.s.d.为0.4Å）。BT1285和BT3987之间的主要结构差异涉及TIM桶的β链（特别是β2链）的长度，以及BT1285中存在更长的柔性环，BT1285活性位点周围的B因子值高于BT3987，在HM底物存在的情况下，B因子值降低（图2b）。围绕活性位点和底物结合袋的整体架构显示，这些HM加工ENGases之间的RMSD为2.4Å。例如，当Man（-5）暴露于BT3987中的溶剂时，它与BT1285中的残基E166和R169形成氢键，而Man（-9）暴露于BTC285中的溶剂，但它与BT3987的残基N403密切接触（图2d）。这些观察结果与甘露糖在结合HM-N-聚糖的两种ENGase的晶体结构中显示的灵活性程度一致，如B因子值所示。

为了进一步研究BT1285如何在分子水平上特异性识别HM底物，以及它与其他HM加工ENGase（如BT3987）的比较，我们对修饰酶β-桶核并接触Man₉GlcNAc₂N连接的聚糖底物的残基进行了丙氨酸扫描诱变分析。我们测定了每个单位点丙氨酸突变体在HM IgG底物上加工HM N-聚糖的能力。具体来说，我们突变了环1（E52A、N54A、D55A）、β-发夹环（N81A和N94A）、环2（H126A）、环3（E166A和R169A）和环5（F222，与GlnNAc核心相互作用）中的残基。如图2e所示，环1的E52A、环2的H126A和环3的E166显著降低了酶对IgG的水解活性（在37°C、pH 7.4下）。残基N81、N94和R169的突变也降低了酶活性，但程度较小。两个非催化残基Glu52和His126的同时突变，这两个残基都与N-聚糖核心结合（图2f），完全消除了BT1285的水解活性，表明这两个氨基酸合在一起对HM底物识别至关重要。总的来说，我们对与HM聚糖接触的BT1285残基的突变分析表明，与核心和天线A和B中的Man（-2）、Man（-3）、Man（-5）和Man（-6）糖的相互作用对于聚糖识别至关重要，而那些具有天线C（α1,3）糖的糖则不适用于底物识别（图2f）。此外，这与BT1285（类似于BT3987）结合三天线杂交型N-聚糖的表观能力一致，因为附着在天线C上的GlcNAc和Gal糖的溶剂暴露。此外，我们验证了HM特异性ENGase，BT1285和BT3987既不能容纳第一个核心GlcNAc上附着有α1,6岩藻糖的复杂型N-聚糖结构（存在于哺乳动物复杂型N-葡聚糖中），也不能容纳作为植物N-聚糖装饰物的核心GlcNAc上附着的α1,3-岩藻糖。虽然所有这些结果都与BT3987的描述相似，但BT3987残基Glu200（类似于BT1285中的Glu52）与Man（-2）和Man（-6）的相互作用并没有像我们在BT1285的突变体E52A中观察到的那样影响其催化活性。

BT1285和BT3987的稳定性和活性受到pH和温度的不同影响

为了进一步了解为什么B.thetaiotaomicron VPI-5482编码两种具有相同N-聚糖特异性的GH18-ENG酶，我们评估了BT3987和BT1285在温度和pH范围内的功能特性。首先，我们使用差示扫描荧光法（DSF；图3a）分析了它们在不同pH水平下的热稳定性。我们发现BT3987在pH 6.0时表现出峰值稳定性，在低pH值下尤其不稳定，而BT1285的稳定性在很大程度上不受pH值的影响。此外，BT1285在所有pH值下都比BT3987更稳定。

图3.BT1285和BT3987酶受温度和pH变化的影响不同。a. BT1285（蓝线）和BT3987（橙线）的热稳定性。分析以技术重复三份进行（n=3）。数据以平均值±SD.b. 表示。在23°C下，使用RNAseB作为底物，在2至9的不同pH范围内，BT1285和BT3987 wt酶的相对活性调节。（n=3技术重复）数据以平均值±标准差表示。c. 仔细检查BT1285与Man₉GlcNAc₂（pdb代码：8U48）复合物晶体结构的卡通表示，显示了与BT3987的不同芳香残基以及可能涉及pH依赖性的残基。活性位点由D161和E163残基组成。d、e. 在2至9的不同pH范围内，使用RNAseB作为底物测量BT1285突变体的相对活性。终点测定技术重复3次（n=3）。数据以平均值±标准差的形式呈现。

接下来，我们确定了pH值对这些内切糖苷酶催化活性的影响。使用完整的糖蛋白质谱（图3b），我们发现BT3987在RNAseB上水解HM N-聚糖的最佳pH值在6.0至8.0之间，在较低和较高的pH值下活性都显著降低，类似于pH值对其热稳定性的影响。相反，BT1285在广泛的pH水平范围内具有高活性，在酸性条件下活性越来越高，这与大多数先前表征的ENGase不同，这些ENGase的最佳pH值约为4.5-7.5（例如EndoH、EndoF1、F2、F3、EndoS和EndoS2）。

我们在两个B.thetaiotaomicron HM ENGases之间交换的催化残基周围发现了两个芳香残基——BT3987中的Tyr315与BT1285中的Trp164处于类似位置，而BT3987的Trp355与BT128五中的Tyr201处于类似位置（图3c）。通过BT1285_W164Y-Y201W突变体交换BT1285中的这些残基，我们观察到比BT1285野生型更类似于BT3987的活性曲线（图3d），尽管这些残基并不能完全解释BT1285和BT3987在催化作用中观察到的差异。我们还发现环3中的His126（而不是Arg169）影响BT1285的最佳pH值（从pH 2到pH 4）。具体来说，与N-聚糖底物结合的His126（图3e）可能通过影响关键酸性活性位点残基（Asp161/Glu163）的pKa值来改变BT1285的最佳pH值，正如之前在GH18家族的酸性几丁质酶和铜绿假单胞菌的精氨酸脱氨基酶中所报道的那样。

N-聚糖的构象可及性影响BT1285和BT3987对它们的识别和水解

这些研究中使用的两种HM糖蛋白底物IgG-HM和RNAseB之间的主要区别在于HM N-聚糖的可及性。在RNAseB中，HM N-聚糖高度暴露，因为它与环中的天冬酰胺残基相连。相反，IgG上的HM N-聚糖与两个IgG重链原聚体上的Asn297残基相连；这些聚糖向内朝向IgG二聚体的中心，需要蛋白质构象变化才能通过内切糖苷酶进行去糖基化。如图1c所示，BT1285和BT3987都能快速水解RNAseB上的HM N-聚糖，但BT1285水解IgG HM上的HM N聚糖的速度比BT3987快得多。因此，我们进一步评估了HM N-聚糖底物的构象可及性如何影响BT1285和BT3987聚糖的识别和水解活性。

为了确定BT1285i和BT3987i与Nglycans的结合亲和力，我们使用（i）捕获IgG1（Man₉、Man₅或CT）的蛋白a传感器芯片或（ii）羧甲基化双核心CM5传感器芯片进行SPR分析，其糖基化形式的RNAseB固定在流动池2上，糖基化RNAseB版本固定在对照流动池1上。我们分析了缔合（k_on）和离解（k_off）速率常数，并尽可能计算了每种相互作用的离解常数K_D。我们的数据清楚地证实了ENGase BT1285和BT3987对HM底物的特异性，因为它们都不能与IgG1上的CT-Nglycans结合（图4）。事实上，我们没有观察到BT3987i与任何IgG底物的可测量结合，无论它是否显示HM或CT N-聚糖。虽然BT1285i和BT3987i均与RNAseB上的Man₅寡甘露糖结合，但BT1285i的结合亲和力比BT3987i高1000倍（KD为3.5 nM对4.3μM）。因此，聚糖可及性在这些结合事件中起着明显的作用，因为BT1285i对RNAseB上暴露的聚糖的亲和力比IgG上受限的聚糖高12倍（K_D为3.5 nM对42 nM）。我们还确定了H126A突变如何影响BT1285i与HM聚糖的结合亲和力。正如预期的那样，BT1285i_H126A对所有测试的HM N-聚糖的亲和力比BT1285i低1000倍，无论它们显示在何种糖蛋白上—RNAseB、IgG-Man₉和IgG-Man₅—证实了His126对结合寡甘露糖苷底物的重要性（图2e和2f）。

图4.SPR研究BT1285i和BT3987i与不同N-聚糖底物的结合亲和力。上图显示了1285i（分析物）与不同N-聚糖底物的结合动力学，这些底物使用胺偶联固定在蛋白质a（Man5、Man9、CT）和CM5传感器芯片（RNaseB）上，表面密度为100-150响应单位（RU）。下图显示了BT3987i（分析物）的结合分析。绘制BT1285i分析物的浓度范围（连续稀释1:2）：IgG-Man5/Man5为37.5 nM至600 nM；IgG-Man₉/Man₉为9nM至300nM；IgG CT为156 nM至5µM，RNAseB为3.75至240 nM。对于绘制的BT3987i分析物浓度范围（连续稀释1:2）：IgG Man₅/Man₅为625 nM至20µM；Man₉/Man₉和CT为156 nM至5µM；RNAseB为1µM至32µM。黑色虚线表示动力学模型上的配件。ND=未确定的KD。分析以独立的重复进行（n=2）。糖符号：蓝色：GlcNAc、绿色：Man、红色：Fuc、黄色：Gal。

为了进一步确定为什么BT1285在IgG底物水解HM N-聚糖方面比BT3987具有如此大的催化优势，我们评估了两种聚糖在IgG同二聚体上的水解动力学。在两个IgG原聚体的Asn297残基上各有一个聚糖，可能存在的糖基化物种包括：双糖基化（两个IgG前聚体上都有Asn297连接的聚糖；初始底物）、单糖基化（只有一个IgG原单体上有Asn297-连接的聚糖，是完全去糖基化反应中的中间体，也是进一步去糖基化度的底物）和去糖基性（两个原聚体上没有Asn297链接的聚糖；最终产物）。如图5a所示，随着时间的推移，BT3987和BT1285对IgG-HM去糖基化的反应速率在所有三种物质（底物、中间体和产物）中表现得尤为明显。对于BT3987，即使在400分钟后，我们也观察到单糖基化IgGHM的积累，而对于BT1285，单糖基化的IgGHM物种迅速出现，在75分钟达到峰值，并在200分钟内完全水解为完全去糖基化的IgG HM。这些测定中单糖基化中间峰的对称性表明，BT1285对二糖基化或单糖基化IgG-HM物种都没有偏好。为了进一步验证单糖基化的IgG-HM中间体不是BT1285水解的特异性靶标，我们使用蛋白a传感器芯片进行了SPR分析，其中固定了二糖基化、单糖基化（在两个原聚体上）或去糖基化的IgG-HM物质，并引入BT1285i作为分析物。如图5b所示，我们观察到BT1285i与二糖基化和单糖基化IgG-HM相互作用的亲和力和动力学相似。这些实验数据还表明，BT1285没有感觉到IgG中可能由一种聚糖水解引起的任何特定构象或动态变化，并支持BT1285仅识别IgG上HM N-聚糖的机制。

图5.BT1285水解和结合IgG同二聚体上两种聚糖的动力学。a. BT3987和BT1285与IgG HM的动力学分析。在HBS缓冲液中，37°C下的三次测定具有代表性。b. BT1285i（分析物）与不同二糖基化、单糖基化和糖苷基化（N297Q）IgG变体的SPR检测。对于单糖基化IgG，分析物的浓度范围为4.7 nM至300 nM，对于去糖基化的IgG，为156 nM至5µM。分析代表了两个独立的实验。糖的符号：蓝色：GlcNAc、绿色：Man。

为了确定BT3987的β-三明治结构域（BT1285中不存在）是否是其水解活性相对降低的原因，我们比较了全长BT3987与其单独的GH18酶结构域的IgG HM水解动力学。我们发现这些酶表现出相似的动力学，表明BT3987β-三明治结构域不是BT3987水解速率较慢的原因，尽管缺乏该结构域大大降低了这种酶的热稳定性（pH 7.4时Tm 52℃ vs 41℃；图3a）。使用相同的抗体底物，但将HMN-聚糖从Man9改为Man5，我们得到了类似的结果，表明聚糖的大小也不是水解速率差异的原因。

BT1285i/Fc-HM复合物中的蛋白质相互作用对于催化活性来说是不必要的

考虑到（i）BT1285i和IgG1 HM之间观察到的高亲和力，以及（ii）相对于BT3987，BT1285在该底物上水解HM N-聚糖的动力学明显更快，我们寻求这些活性的结构基础。通过使用尺寸排阻色谱法（SEC），我们确定BT1285i与Fc-IgG1-HM（图6a）和IgG1-HM形成稳定的复合物，但与IgGCT没有形成预期的复合物。SEC组分的SDS-PAGE分析表明形成了2:1 BT1285i:Fc-HM高度稳定的复合物（图6a）。我们通过分析超速离心（AUC）（图6b）和SEC多角度光散射（MALS）验证了这种复合物的2:1化学计量比。SEC-MALS和AUC估计分子量约为104 kDa，略低于氨基酸序列预测的116 kDa。这些差异可能是由于游离BT1285和Fc之间的动态平衡，因此SECMALS和AUC中的峰都含有与单个BT1285结合的Fc二聚体。总体而言，AUC和SEC-MALS实验的结果与BT1285以每Fc二聚体2个BT1285分子的比例与Fc二聚物的高亲和力结合一致。接下来，我们使用在线SEC进行了小角度X射线散射（SAXS），并重建了BT1285i:Fc HM复合物（约125 kDa）的从头计算低分辨率包络，其中我们拟合了BT1285晶体结构的两个复制和Fc的一个复制（图6c）。此外，我们在低蛋白浓度（0.05 mg mL^-1）下获得了BT1285i和Fc-HM之间的天然稳定复合物，我们通过负染透射电子显微镜（NS-TEM）进行了观察，由于BT1285对Fc上的HM聚糖具有高亲和力，因此不需要像之前报道的EndoS-Fc复合物那样进行化学交联来稳定。通过对BT1285i:Fc HM复合物的NS-TEM分析，我们产生了一个三瓣~19Å的结构，其中BT1285的一个分子被定位为攻击每个Fc原聚体上的Asn297连接的聚糖，并仅与N297上的HM N-聚糖接触，这也支持了2:1的BT1285i/Fc HM化学计量（图6d）。尽管我们的BT1285i:Fc HM复合物结构的分辨率有限，但我们观察到该复合物中可能存在蛋白质-蛋白质界面（图5e）。为了测试这些蛋白质-蛋白质相互作用是否有助于BT1285的酶活性，我们单独或组合突变了BT1285和Fc-HM推定界面中的关键残基，并测量了它们的酶活性（图5f）。

图6.BT1285i-Fc-HM复合物形成分析。a. Superdex S200上运行的BT1285iFc复合体的SEC分析。凝胶过滤洗脱部分的还原和非还原游离染色SDS-PAGE（4-20%）分析。用字母L（梯形图）、C（复合物，注入SEC的分数）表示。实验独立重复三次，结果相似。b. BT1285i、Fc HM和BT1285-Fc复合物的AUC分析（分数对应于图6a中SEC中12.5 ml体积洗脱的分数。HBS缓冲液中的样品在45400 g下离心。曲线表示与SEDFIT中连续c（s）分布模型的拟合。Res=残差。c、d. SAXS c和NS-TEM d数据的3D重建分别揭示了2:1的复杂低分辨率结构。我们在SAXS和NS-TEM图中发现了Fc（pdb代码：5JII）和BT1285i-HM（pdb编码：8URA）的高分辨率结构。e. 仔细检查BT1285i-Man9-Fc界面区，显示两种蛋白质的主要间苯二酚呈棒状。f. Fc（红色）和BT1285（绿色）界面区域中选定突变体的相对ENGase活性测量。分析技术重复三份（n=3）。数据以平均值±标准差的形式呈现。源数据以源数据文件的形式提供。

与野生型BT1285相比，我们没有发现具有显著不同水解速率的突变体，这表明这种蛋白质相互作用对BT1285的高催化速率没有贡献，只有识别HM N-聚糖本身才能驱动催化作用，这与我们之前在IgG特异性ENGase EndoS中观察到的不同，在IgG特异性ENGase Endos5中，IgG-EndoS之间的蛋白质接触对催化作用至关重要。

许多肠道细菌种类编码多种ENG酶，水解相同的HM聚糖底物

在证明了单一的人类肠道微生物B.thetaiotaomicron VPI-5482可以产生两种具有相同HM N-聚糖底物特异性但具有不同功能特性的GH18-ENGase后，我们询问这种现象是否在定植人类的细菌中更为普遍。因此，我们对整个拟杆菌门的PUL进行了生物信息学研究。通过模块化比对分析，我们发现几个物种含有至少两种不同的HM加工ENGase，它们位于不同的PUL中，包括但不限于 B. faecium, B. ovatus, B. xylanisolvens, Alistipes finegoldii 和 A. onderdonkii。这表明，编码具有相同N-聚糖特异性的多种内切糖苷酶可能很常见。我们从A.finegoldii中选择了两种ENG酶进行进一步分析，A.finegoldi是与人类生态失调和几种肠道疾病相关的拟杆菌门的一个相对较新的分支属。我们在SSN分析的C2中发现的Alfi_0882（图1a）与BT3987具有相似的总体结构（与BT3988的序列同一性为48%，与BT1285的序列同同一性是24%），而我们在C3中发现的Alfi_0894（图1a）在其N端缺乏β-三明治结构域，与BT1284相似（与BT1285的序列同一性为38%，与BT398七的序列同一面为25%）。此外，编码Alfi_0882和Alfi_0894的基因位于PUL中，分别类似于编码BT3987和BT1285的B.thetaiotaomicron PUL（图7a）。

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结论

我们表达并纯化了重组版本的Alfi_0882和Alfi_0894，并用这些酶和我们的四种糖蛋白底物标准组进行了C-SEAK分析：Fc CT、RNAseB、转铁蛋白和IgG HM（图7b），以及用IgG HM作为唯一底物的SEAK分析（图7c）。我们证实Alfi_0882和Alfi_0894都是HM加工ENGase。Alfi_0882对HM糖蛋白底物RNAseB和IgG-HM均表现出快速动力学，而Alfi_0894仅对RNAseB表现出快速的动力学，对IgG-HM的水解缓慢。在这方面，Alfi_0782与BT1285相似，而Alfi_0894与BT3987相似。我们还测量了宽pH范围内的热稳定性（图7d）和水解活性（图7e），发现Alfi_0882的功能性质通常与BT3987相似，而Alfi_0894的功能特性与BT1285最相似。奇怪的是，两种HM加工酶Alfi_0894和Alfi_0882都对Man9 IgG表现出很高的结合亲和力。因此，虽然A.finegoldii在HM加工内切糖苷酶方面没有完全复制B.thetaiotaomicron VPI-5482，但这种细菌确实明确编码了两种具有不同功能特性的内切糖苷，这取决于它发挥作用的环境条件以及HM N-聚糖底物的构象可及性。

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-024-48802-3