《Nature Communications》 Vibrio sp. dhg作为褐藻生物精炼的平台

2019 年 6 月，来自首尔大学的Sang Woo Seo等人在Nature Communications上发表了一篇题为Vibrio sp. dhg as a platform for the biorefinery of brown macroalgae的研究性论文。

全球对生物制品的需求正以惊人的速度增长，预计到2025年其市场份额将达到化学工业的22 %。为了满足如此巨大的需求，在过去的几年中，原料的稳定补充和转化至关重要。迄今为止，虽然淀粉类作物已被广泛应用，但在粮食资源消耗和有限的栽培能力方面仍存在许多顾虑。在这方面，褐藻已被建议作为替代原料。褐藻数量巨大，具有较高的碳水化合物含量(干重的35 ~ 60 %)。它们能够比木质纤维素类生物质生长得更快，并且只需要阳光和海水。

褐藻中最突出的糖类是褐藻胶( α-L-古洛糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸的共聚物)和甘露醇。虽然传统的微生物平台(例如,大肠杆菌( Escherichia coli ))可以很容易地代谢甘露醇，但由于缺乏某些相关基因，其同化褐藻胶的能力受到阻碍；已知褐藻胶代谢需要大约10 ~ 20个编码转运蛋白、裂解酶和代谢酶的基因。尽管最近的研究表明，大肠杆菌可以通过引入一个巨大的基因簇来利用天然褐藻胶代谢微生物的褐藻胶，但它们的生长速度和代谢活性仍然太低，无法用于工业应用，这可能是由于多种异源基因的未优化表达。

由于宿主微生物的生长速率和代谢活性都会极大地影响生物过程的性能，因此开发同时具有高生长速率和高代谢活性的高效宿主是获得高生产率的关键。因此，天然能够利用褐藻胶的微生物应该被认为是褐藻胶原料的首选微生物平台。由于在整个进化历史中的自然优化，与传统微生物的工程改造相比，这些微生物可能具有更高的代谢褐藻胶的能力。因此，这些天然存在的微生物将更适合作为一种微生物平台，用于从褐藻糖中生产各种增值的生化物质。

在本研究中，分离到一株能够高效利用褐藻胶的快速生长的微生物。研究人员将这种微生物命名为Vibrio sp. dhg，并对其进行系统鉴定，开发基因工程工具箱。通过作为微生物平台的开发，展示了褐藻糖的多种增值生化生产，具有较高的生产率和产量。根据这些结果，提出将Vibrio sp. dhg作为褐藻生物精炼的平台。

1.一株利用褐藻胶的微生物的分离

为了分离利用褐藻胶的微生物，将收集的海藻污泥接种于以褐藻胶为唯一碳源的微量培养基中。在30℃下经过几轮传代培养后，成功分离出一株快速生长的杆状微生物( (最大比生长速率( μ )) = 0.98 h^-1)(图1a)。该菌不仅能利用褐藻胶，还能利用其他生物质衍生糖(例如,葡萄糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘油)。值得注意的是，在大多数糖的情况下，30℃时的生长和糖吸收速率明显高于或至少与37℃时葡萄糖培养的大肠杆菌相当(图1b,c)。

此外，该菌即使在高浓度盐( 100 g L-1氯化钠)中也能生长，而其他工业宿主( E.coli ,谷氨酸棒状杆菌, Saccharomyces cerevisiae )则表现出严重的生长速率降低。对其他代表性生物制品(乙醇, 2 , 3 -丁二醇( 2,3-BDO ))、乳酸)的耐受性也进行了考察。在乙醇存在的情况下，该菌与谷氨酸棒杆菌相似，在培养基中乙醇浓度为50gL^{-1时仍能维持生长。对于2，3 - BDO，它与大肠杆菌相似，但比谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母更敏感；50 g L-1的2，3 - BDO抑制菌体生长。最后，在乳酸的存在下，其耐受性略小于酿酒酵母的耐受性，其在50 g L-1乳酸盐存在下显示出最佳生长。总的来说，尽管它的耐受性并不比谷氨酸棒杆菌或S .cerevisiae优越，但它与E .coli相当，这表明该微生物可以用作生化生产的宿主。}图1.Vibrio sp. dhg作为大型褐藻生物炼制微生物平台的研究。a Vibrio sp. dhg褐藻胶和甘露醇同化途径的模式图。解聚的褐藻胶寡糖被运输到细胞质中并被消化成4-脱氧-L-异丙基-5-己糖醛酸酯，(DEHU)。DEHU进一步转化为3 -磷酸甘油醛( G-3-P)和丙酮酸( PYR )。甘露醇通过PTS系统转运到细胞质中，并转化为果糖- 6 -磷酸( F-6-P)。插图是Vibrio sp. dhg的扫描电子显微镜( SEM )图像，显示1 μ m的刻度条。其他的缩写如下：ED途径Entner - Doudoroff途径，EMP途径Embden -迈耶霍夫- Parnas途径，KDG 2-keto-3-deoxygluconate，KDPG 2-keto-3-deoxy-6-磷酸葡萄糖，M-1-P Mannitol-骨质疏松，F-1，6-BP果糖1,6-二磷酸酯酶，DHAP磷酸二羟丙酮，1，3-BPG 1，2,3-二磷酸甘油酸，3-PG 3-磷酸甘油酸的阴离子形式，2-PG 2-磷酸甘油酸的阴离子形式，PEP磷酸烯醇丙酮酸，CIT citrate ACN顺乌头酸酶，ICT异柠檬酸盐，aKG α－酮戊二酸，SUC succinate，FUM fumarate，MALmalate，OAA草酰乙酸。b 30 ° C条件下，Vibrio sp. dhg在添加4 g L - 1不同碳源的基本培养基中的最大比生长速率( h^-1)和c最大糖吸收速率( ( g g - 1细胞干重( DCW )) h^-1)。两条横线表示37 ° C条件下，E.coli在葡萄糖基本培养基中的生长速率( 0.60 h^-1)和糖吸收速率( ( 1.96 g g^-1 DCW h^-1) )。d 基于RNA-Seq结果，与葡萄糖同化过程相比，褐藻胶和甘露醇同化过程中基因表达的倍数变化。e Vibrio sp . dhg同时同化褐藻胶和甘露醇。封闭黑色圆圈，OD600；封闭倒三角形，褐藻胶；打开红色三角形，甘露醇。误差棒表示三个独立文化的标准差( n = 3)。白点表示实际数据点。

为鉴定该菌，利用通用引物对其16S r DNA序列进行分析，发现其属于弧菌科家族。特别是，它与革兰氏阴性菌需钠弧菌(vibrionatriegens) ATCC14048 ( 99 %一致性)高度相似，由于其快速生长速度(在富培养基中倍增时间< 10min)，最近被认为是分子生物技术的有前途的宿主。通过对分离的微生物(图2)的基因组测序，获得了代表一个大染色体、一个小染色体和一个质粒的三个环状重叠群。虽然已知有几种弧菌使用褐藻胶(如V.alginolyticus 和V.splendidus 12B01)，但其生长速率远高于已知微生物(0.2~0.8h^-1)的报道值。此外，微生物的基因组背景和表型特征更接近于弧菌ATCC14048。然而，通过详细的生理比较发现，两种微生物之间存在差异，可能是由于它们的基因组有超过5 %的变异。特别是，弧菌不具备代谢褐藻胶所需的机械。因此，将菌株Vibrio sp. dhg命名为Vibrio sp. dhg，并进一步研究了其作为褐藻生物炼制平台的潜力。基因组注释显示，Vibrio sp . dhg中许多负责褐藻胶同化的基因位于其小染色体(第2染色体)内的一个42 kb的簇中。与已研究较多的V. splendidus基因簇序列比对表明，该菌株也通过多步过程同化褐藻胶(图1a )。具体来说，内溶型褐藻胶裂解酶分泌到胞外将褐藻胶解聚成褐藻胶寡糖。然后褐藻胶寡糖通过转运体转运到细胞质中。随后，在外切褐藻胶寡糖裂解酶的作用下产生褐藻胶单体(4-脱氧-L-异丙基-5-己糖醛酸酯，DEHU)。最后，通过部分Entner - Doudoroff路径，DEHU还原酶( DehR )、2-酮基-3-脱氧葡萄糖酸激酶(KdgK)和2-酮基-3-脱氧磷酸葡萄糖酸醛缩酶(Eda)将DEHU转化为3 -磷酸甘油醛和丙酮酸，这两种代谢产物随后进入糖酵解。另一方面，大染色体上含有2个甘露醇操纵子拷贝(第1染色体)。甘露醇最初是通过甘露醇特异性的磷酸转移酶系统( PTS，磷酸转移酶系统)转运进入细胞的。Mtl A经甘露醇-1-磷酸脱氢酶(Mtl D)转化为糖酵解中间产物果糖-6-磷酸。

为了证实上述基因对褐藻胶和甘露醇同化至关重要，研究人员通过RNA测序分析了它们的表达水平。正如预期的那样，这些基因被同源糖的添加高度诱导（与葡萄糖条件相比增加高达100倍）(图1d )。此外，观察到Vibrio sp. dhg可以同时消耗褐藻胶和甘露醇(图1e )。由于这两种糖具有不同的氧化状态，这种性质对于在限氧环境中进行生化生产(例如,乙醇)具有很大的优势。因此，Vibrio sp . dhg非常适合使用褐藻胶-甘露醇混合液。图2.Vibrio sp. dhg .的基因组信息。a-c，a，1号染色体，b，2号染色体，c，质粒的环形图。从外圈开始描绘正向编码序列(深蓝色)、反向编码序列(深蓝色)、t RNA (绿色)、r RNA (红色)、GC plot (黑色:低于平均值,灰色:高于平均值)、GC斜线(黑色:低于平均值,灰色:高于平均值)。d，注释基因组信息,使用子系统快速注释技术( RAST )分析)服务器绘制图像。

2.Vibrio sp. dhg的基因表达调控

为了利用Vibrio sp . dhg作为微生物平台，构建和优化(异源)代谢途径的基因工程工具必须首先容易获得。作为一种基本的方法，将几种不同来源的复制型质粒( p MB1、RSF1030、p15A、Clo DF13)导入Vibrio sp . dhg菌株中。利用最初建立的V . natriegens的转化方案，观察到除CloDF13外的所有质粒都能稳定存在。此外，在多种抗生素存在的情况下，可以维持两个以上不同的质粒。

接下来，研究了Vibrio sp. dhg中驱动基因表达的转录特征。通过比较其管家基因sigma因子(σ70)与大肠杆菌的氨基酸序列，发现其主要的DNA结合结构域(区域2.4和4.2)和(图3)完全相同。此外，在Vibrio sp. dhg中高表达的核糖体基因启动子区也具有与细菌- 35和- 10 box ( TTGACA和TATAAT)相似的序列( TTGANN和TATAAT)。这些发现表明，大肠杆菌常用的启动子也可以与Vibrio sp . dhg兼容。为了验证这一想法，研究人员在常规启动子PJ23119、Plac、Ptac、Ptet和Para控制下制备了编码sgfp (超折叠绿色荧光蛋白)基因的质粒。这些质粒还携带同源阻遏表达盒(来自E.coli的lac I和ara C盒,以及一个综合设计的tet R盒)，用于诱导表达。正如预期的那样，当内源性RNA聚合酶转录时，能够在Vibrio sp. dhg中观察到sgfp基因的成功表达(图4a)。此外，T7 RNA聚合酶基因(在Plac启动子的控制下)的表达也会导致sgfp在PT7启动子控制下的表达。此外，当加入同源诱导剂(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷( IPTG ))、脱水四环素(aTc)或阿拉伯糖时，所有的诱导型启动子都表现出对(最高可达184倍)的强烈激活作用。

图3.来源于Vibrio sp. dhg和E . coli的sigma因子70的序列比对。查询序列和主题序列分别为Vibrio sp. dhg σ70 (623个氨基酸)和E . coli σ70 (613个氨基酸)的氨基酸序列。已知E . coli 70的2.4和4.2区域与启动子11，12的- 10和- 35框相接触。使用BLAST进行序列比对(最大得分, 926 ;总分, 926分;查询覆盖率, 100 % ; E -值, 0.0 ;同一性百分比, 77.37 %)。

为了在转录水平上实现对基因表达的精确调控，研究人员构建了一个人工合成的启动子文库。该文库是用简并序列(即, YTKAYR和KAYWRT)修饰PJ23119启动子的-35和-10框，以覆盖Anderson启动子文库。通过改变启动子序列，成功获得了15个不同强度的启动子(命名为启动子VP1 ~ 15)，最大差异倍数为41 (图4b)。基于研究的数据，能够构建一个预测模型，该模型可以估计启动子强度，并且具有很强的预测能力( R² = 0.72)。与观察到的强度一致，该模型预测启动子VP15是最强的。因此，该模型可以用于其他合成启动子的开发，并通过迭代学习进一步完善。

在翻译水平上研究了Vibrio sp. dhg中的基因表达调控。最近，由于翻译起始过程的生物物理模型，细菌中翻译效率的预测成为可能。该模型在大肠杆菌中得到了充分的验证，计算了5′非翻译区( ΔGUTR )的热力学自由能变化。虽然Vibrio sp. dhg的16S r DNA与E.coli的16 S r DNA具有较高的相似性( 90 % )和相同的anti-Shine-达尔加诺序列( ACCTCCTTA )，但该生物物理模型仍需要在Vibrio sp. dhg中进行验证。因此，为了证实Vibrio sp. dhg中翻译效率的可预测性，利用UTR Library Designer16构建了覆盖sgfp表达水平的5′- UTR文库。总的来说，研究人员分析了13个5′- UTR变体，发现基因表达成功改变。更具体地说，核糖体结合位点和折叠特征的改变能够产生表达差异高达53倍的变异体(图4c)。更重要的是，这些测量值与预测值高度相关的( R2 = 0.79)，从而表明该模型在Vibrio sp. dhg中具有很强的预测能力。综上所述，在Vibrio sp. dhg中，转录和翻译都可以以可预测的方式进行控制，这一特性对于构建高效的代谢途径非常有用。此外，先前为大肠杆菌开发的许多基于质粒的生产系统或遗传回路可以直接用于Vibrio sp. dhg，而无需任何重大修改。图4. Vibrio sp. dhg中基因表达的精确控制。a评估组成型启动子( PJ23119 ,相当于PVP15)和各种诱导型启动子( Plac、Ptac、Ptet、Para、PT7)在sgfp表达方面的作用。对于诱导表达，添加1 mM IPTG，100 μg mL - 1aTc或10 g L - 1阿拉伯糖。* * * p < 0.001 (双侧t检验)。b各种合成启动子控制下sgfp表达的相对荧光值。每个荧光值以最高值进行归一化处理。c不同5′- UTRs功能的sgfp表达的相对荧光值。每个荧光值以最高值进行归一化处理。嵌入图表明预测的折叠能( ΔGUTR )和测量的荧光值之间具有高度的相关性( R² = 0.79)。背景荧光( VDHG001菌株的荧光)的值进行了调整。误差棒表示3个独立文化( n = ③)的标准差。白点表示实际数据点。

3.Vibrio sp. dhg基因组编辑

由于基因组编辑对于开发高效的细胞工厂是必要的，因此探索了对Vibrio sp. dhg进行基因组编辑的可能性。为了对其基因组进行改造，选择了弧菌科中天然存在的SXT重组系统。据报道，exo (一个编码碱性外切酶的基因)和beta (编码单链退火蛋白的基因)的表达允许在弧菌和大肠杆菌中重组。在其基因组工程中，Vibrio sp . dhg的内源exo和beta在Ptac启动子和人工合成的5′- UTR的控制下表达。此外，来自lambda噬菌体的γ (一个编码核酸酶抑制剂的基因)被表达以促进重组。作为等位交换的模板，引入了一个氯霉素抗性( cat )盒，其两侧含有两个相同的FRT序列和靶位点的同源臂( 1 ~ 3个 kb)。电转后，通过检查可以在氯霉素琼脂平板上生长的菌落来确认工程位点。的确，研究人员发现了目的基因被cat基因(图5a)成功替换的菌落。随后，通过表达来自酿酒酵母的FRT特异性翻转酶，整合的cat基因很容易被去除。图5.琼脂糖凝胶电泳验证基因组编辑。a，插入FRT - cat - FRT片段缺失dns基因。泳道1：阶梯式；泳道2：阴性对照( 1、118bp)；泳道3：dns位点( 1,512 bp)等位交换后；泳道4：FLP翻转酶表达后( 494 bp )。b，泳道1和2，dns ( 1、118bp ~ 494bp)缺失；第3、4泳道，缺失ldh A ( 870 ~ 362 bp)；泳道5：阶梯式；泳道6和7，frd ABCD ( 4 149 ~ 1 224 bp)基因缺失；泳道8和9，pfl B ( 2 801 ~ 839 bp)的缺失。两种凝胶电泳实验均采用相同的梯形图。

4.褐藻胶和甘露醇混合物的生物化学生产

在建立了Vibrio sp. dhg的遗传工具箱后，尝试使用工程化的Vibrio sp .dhg菌株生产增值的生物化学品。虽然已知褐藻的糖组成受地理和季节变化的影响，但为了充分评估其性能，选择褐藻胶和甘露醇以1：2的比例混合制备模拟糖培养基。首先，在微氧条件下尝试了生物燃料乙醇的生产(图6a)。由于野生型菌株同时具有乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶，因此可以通过培养野生型菌株还原乙酰辅酶A来生产乙醇。为了产生更多的乙醇，表达了酵单胞菌属mobils6的丙酮酸脱羧酶( pdc )和乙醛脱氢酶( aldB )基因(图6a)。为了获得最大程度的组成型表达，将每个基因融合到一个人工合成的5′-UTR上，并将其置于最强的合成启动子VP15的控制下。该菌株显著提高了乙醇产量( 7.7 g L^-1 ,增加4.8倍)和降低了副产物(共2.3 g L - 1)的积累水平。为了进一步减少副产物的生成，删除了内源的ldh A (乳酸脱氢酶)、frd ABCD (延胡索酸还原酶)和pfl B (丙酮酸-甲酸裂解酶)基因，构建了VDHG411菌株。该去除成功地减少了碳(总共只有1.1 g L^-1的副产物)的损失，同时略微提高了乙醇产量( 8.4 g L^-1,即增加10 %)。通过补料分批发酵，以1：2的比例共提供80 g L^-1的混合糖，VDHG411菌株在24 h内产生25.7 g L^-1( 3.3 % v / v )的乙醇(图6b)。令人惊讶的是，1.1 g L^-1 h^-1的平均乙醇产率(最大值1.8 g L^-1 h^-1)显著高于其他利用褐藻胶的微生物平台。此外，VDHG411菌株的产量(64%的理论最大值)与其他褐藻胶消耗型微生物平台的产量相当。

5.褐藻发酵生产乙醇

最后，测试了以褐藻为原料的乙醇生产(图7)。海带粉的糖含量定量为0.16 g褐藻胶和0.3 g甘露醇每克粉末，与模拟糖混合物的组成一致。因此，海带粉可以直接作为原料使用。当VDHG411菌株在含有1 L培养基的生物反应器中培养时，在24 h内共提供120 g L^-1的海带粉。

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结论

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019-10371-1