《JAFC》使用喷雾干燥酶固定化褐藻胶颗粒

2022年6月，Yilun Weng等人在Journal of Agricultural and Food Chemistry上发表了一篇名为Alginate Particles for Enzyme Immobilization Using Spray Drying的研究性论文。

1.1 使用喷雾干燥制备负载植酸酶的褐藻胶颗粒。在本研究中，使用简单的喷雾干燥法合成了用于固定植酸酶的海藻酸钙颗粒（图1）。喷雾干燥饲料是通过将褐藻胶和植酸酶在水中混合，然后在喷雾干燥前加入钙源来制备的。为了防止钙离子和褐藻胶在喷涂前交联，导致喷嘴堵塞，需要pH触发钙离子的释放。已经开发了不同的pH触发钙离子释放方法。这项工作使用琥珀酸和氨来管理pH值的转换。饲料含有褐藻胶、碳酸钙、植酸酶、琥珀酸和氨（图1（1））。将进料的pH值调节至5.6，其中大部分钙仍以碳酸钙的形式存在。在雾化过程中（图1（3）），氨蒸发并降低了pH值，使碳酸钙转化为钙离子，使其可与褐藻胶交联。液滴在干燥室中进一步干燥，由于真空力的作用，最终产品在旋风收集器中获得（图1（4））。图1.样品制备和喷雾干燥过程示意图。（1）喷雾干燥饲料溶液，包括褐藻胶、碳酸钙、植酸酶、琥珀酸和氨（2）喷雾干燥喷嘴（3）雾化后的交联液滴（4）收集器中的产品粉末。

1.2 植酸酶活性恢复研究。酶活性恢复至关重要，因为需要保持最大的酶活性。一些固定化技术大大降低了酶的活性，其中酶被化学修饰并共价键合到不同的载体上。为了研究喷雾干燥前后植酸酶活性的变化，开发了一种测定方法。植酸酶活性恢复率（AR）定义为喷雾干燥后保留的植酸酶活性比例，直接从活性测定中获得（图2）。使用喷雾干燥制备了三种植酸酶固定化褐藻胶微粒样品，包括A2P0.5、A1P0.5和A2P1。三个样本的AR均在98%以上，其中A2P0.5的AR率最高，达到100%。这表明喷雾干燥过程本身不会对植酸酶活性产生负面影响，并且可以实现约100%的植酸酶活性恢复。图2.三种喷雾干燥样品的活性恢复率。数值为平均值±标准差（n=4）。

喷雾干燥不会影响植酸酶活性，因为热敏材料的雾化速度快，停留时间短。通常，在双流体喷雾干燥喷嘴中，空气流速通常在100m/s以上。此外，当喷雾的液滴接触热空气时，大部分能量是通过水蒸发消耗的。因此，热敏材料的实际温度远低于温度探头检测到的温度。Obon等人报告称，在入口温度为200℃的情况下，喷雾干燥后α-淀粉酶保留了其原始活性的83%以上。

1.3 热稳定性研究。植酸酶的热稳定性是评价植酸酶热稳定性的重要参数之一。在此，我们开发了一种湿热方法来模拟工业造粒过程的蒸汽加热条件。本研究通过比较游离植酸酶和固定化植酸酶在热处理后的残留活性，研究了固定化对酶热稳定性的影响。

为了准确表示制粒过程，由于水分含量对蛋白质热稳定性的显著影响，开发了一种湿式加热方法。加热过程中较高的水分含量使酶更难存活，因为水在高温下会破坏酶分子之间和内部的氢键。氢键的断裂改变了酶的三级结构，从而导致失活。造粒是当前动物饲料制造业中最常见的工艺，因为它提供了显著的好处，如减少饲料损失和提高饲料转化效率。在制粒过程中，植酸酶和食品成分的混合物在约90°C的蒸汽中浸泡45秒，导致植酸酶活性丧失。因此，建立了一种湿热法来模拟工业造粒条件，并研究植酸酶的热稳定性。为确保加热方法的有效性，每10mg样品使用100μL水作为最终条件。由于不同地方造粒过程的含水量不同，含水量高于报告的工业条件。

使用加热块在95°C下将四个样品与水分加热1分钟，包括游离植酸酶和褐藻胶固定植酸酶（A2P0.5、A1P0.5和A2P1），并对其残留活性进行表征（图3a）。在三种喷雾干燥样品中，样品A2P0.5的热稳定性最高（59%），其次是A1P0.5和A2P1（约30%）。热稳定性的差异可能是由于样品的初始褐藻胶/植酸酶质量比不同。在没有支持物的情况下，纯植酸酶的活性损失了95.8%（仅保留了4.2%），而A2P0.5组在固定后保留了近60%的原始活性。植酸酶与褐藻胶等多糖之间的氢键等非共价相互作用和疏水相互作用提高了植酸酶的热稳定性。我们的研究结果表明，酶固定化大大提高了其热稳定性，因为固定化酶在热处理后的活性明显高于未胶囊化的酶。

图3.喷雾干燥植酸酶和游离植酸酶的热稳定性（a）和相对植酸酶含量（b）。数值为平均值±标准差（n=4）。***：p<0.005。

1.4 酶负荷研究。酶负载对于评估所开发的酶固定化方法是否适用于实际应用非常重要。使用两种测定法，即酶活性测定法和蛋白质浓度测定法，研究了三种固定化植酸酶样品的植酸酶负载量，结果分别表示为负载-A和负载-M（图4）。植酸酶负载量通过改变喷雾干燥饲料中的初始植酸酶浓度来控制。从两种不同的测定方法中获得了一致的加载结果，而蛋白质浓度测定与酶活性测定相比显示出更小的实验误差。样品A2P0.5至A2P1的负载量随着植酸酶初始浓度的增加而增加（图4）。由于在饲料中添加了28-41%的琥珀酸，所有三个喷雾干燥样品的植酸酶负载量均为10-20%，琥珀酸因不挥发而留在最终产品中。

图4.使用两种不同的测定方法，酶活性测定（负载-A）和蛋白质浓度测定（负载-M），测定喷雾干燥前固体饲料中的植酸酶浓度和喷雾干燥后植酸酶负载量（%w/w）。数值为平均值±标准差（n=3）。Phy initial cc*：喷雾干燥前固体饲料中植酸酶的初始浓度。

我们的研究旨在开发用于动物饲养应用的包封植酸酶，因此固定化酶活性比固定化酶的质量更重要。比较了三种植酸酶固定化样品和游离植酸酶的热稳定性（图3a）和负载（loading-A，图3b）。在没有固定化的情况下，游离植酸酶的相对植酸酶含量被视为100%。由于添加了褐藻胶等固定化材料，植酸酶固定化样品的植酸酶负载量下降，而与游离植酸酶相比，热稳定性显著提高。由于样品A2P0.5在三个喷雾干燥样品中具有最高的热稳定性，因此A2P0.5将用于进一步的表征。

1.5 植酸酶的分布和形态。为了进一步研究植酸酶在产品中的分布，在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下观察了含有FITC标记植酸酶的喷雾干燥样品。图像中的大多数颗粒显示绿色荧光（图5a），表明植酸酶成功包封在这些海藻酸钙颗粒中，分布相对均匀。图5b、d显示植酸酶在一些大颗粒中向外围集中。这可以用高温喷雾干燥过程中水从液滴内部突然蒸发到外部来解释。这种突然的蒸发将含有植酸酶的水拖向液滴的外边缘，导致液滴表面附近的浓度梯度很大。驱动力也可能导致大颗粒内部出现一些空洞（图5b，d）。

图5.不同放大倍数下FITC标记的植酸酶喷雾干燥粉末的共聚焦图像。（a，b）FITC植酸酶的暗场图像和（c，d）FITC植糖酶的光场图像。

使用扫描电子显微镜（SEM）对褐藻胶颗粒的尺寸和表面形态进行了表征。这些颗粒通常是球形的，直径在2到10μm之间（图6），表面相对粗糙。与负载植酸酶的颗粒相比，未负载褐藻胶颗粒的SEM图像显示出相似的形态和尺寸。喷雾干燥进料中金属离子的类型和电荷会影响颗粒表面的粗糙度。最近关于金属盐对喷雾干燥颗粒表面形态影响的研究表明，单价阳离子盐如NaCl会导致形成表面明显粗糙的颗粒。粒径分布是喷雾干燥产品的重要参数，喷雾干燥多糖基颗粒的粒径分布范围也很广。尽管喷雾干燥颗粒的尺寸取决于几个参数，但喷嘴尺寸和进料溶液浓度是决定最终颗粒尺寸和尺寸分布的主要因素。粒度分布对动物饲料工业很重要，因为良好的粒度分布有助于在动物饲料中均匀分布饲料添加剂。

图6.A2P0.5产品在9000×（a）、3000×（b）、1500×（c）和430×（d）不同放大倍数下的SEM图像。

为了实现良好的粒度分布，已经报道了有效的方法，例如通过缩小喷雾液滴的粒度分布。液滴之间的相互作用，如液滴碰撞和反弹，已被发现会增加液滴尺寸分布。为了产生均匀的颗粒，可以使用压电换能器将进料流分解成单个液滴，从而在实验室喷雾干燥器中形成均匀的液滴。此外，值得注意的是，高喷嘴压力和高喷雾速率也可能导致更宽的液滴尺寸分布。因此，预计喷雾干燥颗粒的尺寸分布可以通过操纵干燥条件以及进料溶液的性质来控制。

1.6 释放研究。酶生物利用度是固定化酶颗粒潜在应用的重要参数。酶的生物利用度可能会因环境条件导致的酶活性降低以及酶的不完全释放而受到损害。因此，需要一个合适的释放系统来最大限度地提高植酸酶的生物利用度。先前关于pH值对植酸酶活性影响的研究表明，植酸酶仅在酸性条件下（家禽GIT的上部）具有活性；因此，需要植酸酶的突然释放。

为了评估饲料消耗后包封酶的生物利用度，进行了体外植酸酶释放研究。为了模拟鸡肉和腺胃的pH值和温度，使用醋酸钠缓冲液（pH 5.5和3.5）在39°C的温度下溶解颗粒。使用EDTA缓冲液（0.2 M，pH 6）降解颗粒，从而实现植酸酶的完全释放。EDTA中的植酸酶活性在60分钟时达到峰值，之后保持平稳（图7，pH 6 EDTA）。因此，在EDTA缓冲液中释放4小时后获得的植酸酶活性被视为完全释放，并用于确定植酸酶释放曲线。。

根据食物在鸡GIT片段中的平均保留时间，我们的结果表明，在模拟作物溶液（pH 5.5）中释放了85%以上的植酸酶，在模拟GIT条件的前两个片段中释放了95%以上的总植酸酶（图7，pH 5.5和3.5缓冲液）。为了评估酶从褐藻胶颗粒中的释放机制，将植酸酶的释放曲线拟合到三种常见的动力学模型中。发现作物中植酸酶的释放（第一阶段）遵循一级模型，而Higuchi模型在第二阶段最适合腺胃的释放。这种突释主要是通过扩散和溶胀实现的，这是基于褐藻胶的系统的主要机制。褐藻胶骨架的膨胀在较低的pH值下减少，导致植酸酶在第二阶段的释放延迟（图7，pH 3.5）。共聚焦图像上显示的一些大空心颗粒的存在（图5）也归因于植酸酶的突然释放，因为该酶靠近颗粒表面。为了进一步证实固定化植酸酶的良好生物利用度，未来需要进行体内动物试验。总体而言，本研究实现了植酸酶的快速完全释放，这对其未来的实际应用具有吸引力。

1.7 产品质量产量。批量生产在工业中很重要，人们已经做出了巨大努力来最大限度地提高产量。我们测量了三个喷雾干燥样品的质量收率，发现进料条件对喷雾干燥器的质量收率（23-25%）没有影响（表1）。通常，由于干燥室壁上产品的损失和废气中细颗粒（<2μm）的排放，实验室规模的喷雾干燥器的产量相对较低（15-50%）。然而，当操作方法从目前的批量生产转变为大规模的连续生产时，产量可以大大提高。通常，工业规模喷雾干燥机的产量接近100%。

表1.产品重量和质量产量

1.8 与其他植酸酶固定化研究的比较。迄今为止，由于植酸酶在动物饲料工业中的广泛应用及其较低的热稳定性，已经开发了各种植酸酶固定化方法来提高植酸酶的热稳定性（表2），表明酶固定化后的热稳定性有所提高。由于不同加热条件下测得的“酶热稳定性”差异很大，因此很难比较不同固定化植酸酶的性能。此外，表3中列出的大多数工作在热稳定性研究中没有使用足够的加热，因为使用的加热温度（例如55-80℃）远低于实际的造粒过程（>90℃）。除了热稳定性外，固定化植酸酶的生物利用度也非常重要，因为它决定了动物食用后可用的植酸酶的活性量。然而，之前的大部分工作都没有包括相关的生物利用度研究。此外，许多固定化过程涉及使用有毒成分作为载体材料或交联剂（如戊二醛和重金属），这使得它们在食品工业中的应用变得困难。因此，开发一种不需要任何有毒试剂的固定化方法非常重要。实际工业应用的另一个考虑因素是可扩展性，但之前的大多数研究仅限于实验室规模的生产。因此，喷雾干燥为固定化植酸酶的规模化生产提供了一种可行的策略。

表2.植酸酶耐热固定化工业应用综述

03

结论

综上所述，我们已经证明了植酸酶固定化褐藻胶微粒的合成可以提高植酸酶作为模型酶的热稳定性。使用实验室规模的喷雾干燥器实现了褐藻胶的原位交联和干燥。产物颗粒为球形，平均直径为2-10μm。CLSM和SEM成像表明植酸酶成功固定在褐藻胶上。开发了不同的测定方法来表征包封参数，如质量收率、植酸酶负载率、活性恢复率、释放曲线和热稳定性。固定化植酸酶的热稳定性比游离酶提高了54%。体外释放研究是在家禽GIT的模拟条件下进行的，植酸酶在禽类GIT的前两段成功释放了95%以上。如本报告所示，褐藻胶颗粒是一种有前景的高温条件下包封酶的材料。喷雾干燥法适用于工业应用，因为它简单、经济高效且可扩展。

DOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.2c02298