《JAFC》具有生成β-葡聚糖寡糖的转糖基酶活性的β-1,3-葡聚糖酶的生化表征
文摘
科学
2024-12-11 16:09
江苏
2024年11月，来自上海大学的Zhen Qin等人在Journal of Agricultural and Food Chemistry上发表了一篇题为Biochemical Characterization of a β-1,3-Glucanase from Bacteroidetes sp. Having Transglycosylase Activity Suitable to Synthesize β-Glucooligosaccharides的研究性论文。
通讯单位：School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China
Abstract
β-1,3-葡聚糖酶在功能性寡糖制备、植物保护和酿酒等领域具有广阔的应用前景。本研究从大盐湖的微生物宏基因组中鉴定出了一个来自Bacteroidetes bacterium的糖苷水解酶（GH）17家族β-1,3-葡聚糖酶（BbGlc17A）。BbGlc17A催化昆布多糖水解转化为聚合度为3−8的β-葡聚糖寡糖。BbGlc17A的最佳催化条件为pH 6.5和30℃。除了水解活性外，BbGlc17A还表现出转糖苷酶活性，包括催化新的β-1,6-糖苷键的形成。BbGlc17A具有典型的（β/α）8 tim桶状结构和细长的催化groove，与其他典型的β-1,3-葡聚糖酶不同，它促进了转糖苷反应的正向进行。这有效地突出了酶将β-1,3-葡聚糖转化为混合功能寡糖的潜力。这些结果揭示了GH家族17 β-1,3-葡聚糖酶的催化性质和应用潜力，并为糖活性酶在生物化学中的应用提供了有价值的信息。
β-1,3-葡聚糖是一种重要的天然多糖，存在于各种生命形式中，由于其多种生物学功能而发挥着至关重要的作用。这些功能包括调节免疫系统，支持肠道益生菌的增殖，调节血糖和降低胆固醇。大多数生物β-1,3-葡聚糖（如凝乳聚糖、酵母β-葡聚糖、昆布多糖和茯苓多糖）都是以β-1,3-糖苷键为主链，通过支链修饰而成。β-1,3-葡聚糖作为脂肪替代品、增稠剂、功能剂和膳食纤维广泛应用于食品工业。β-1,3-葡聚糖具有多种用途和诸多优点，是一种有价值的功能性食品原料，具有重要的研发前景和广泛的应用前景。参与β-1,3葡聚糖代谢的酶系统主要包括三种酶：内切-β-1,3葡聚糖酶（EC 3.2.1.39）、外切-β-1,3葡聚糖酶（EC 3.2.1.58）、和β-1,3糖基转移酶（EC 2.4.1.-）这些酶在细菌、真菌、植物和昆虫中表达，表明来源广泛。β-1,3-葡聚糖酶是一种通过破坏β-1,3-糖苷键来水解β-1,3-葡聚糖的酶。β-1,3-葡聚糖酶的用途广泛，包括生物防治、制备功能性寡糖、啤酒酿造和去除生物膜。β-1,3-葡聚糖酶水解β-1,3-葡聚糖具有高特异性和低副产物的优点，是一种很有前途的功能性寡糖生产方法。根据序列相似性，糖酶数据库将糖酶分为不同的蛋白家族，所鉴定的内切-β-1,3葡聚糖酶与12个糖苷水解酶（GH）家族相关：5、16、17、55、64、81、128、152、157和158。17家族是一组经过严格研究的糖苷水解酶，突出表现为β-1,3-葡聚糖代谢酶。GH17家族β-1,3-葡聚糖代谢酶已被发现在植物、真菌和细菌的不同代谢过程中发挥重要的生物学作用。例如，植物GH家族17 β-1,3-葡聚糖酶显然是致病相关蛋白(PRs)，在植物防御真菌疾病的机制中至关重要。这些蛋白质在控制植物病害方面起着关键作用相反，真菌GH17家族β-1,3-葡聚糖代谢酶通过水解和转糖基酶作用形成交联的刚性网络，在真菌细胞壁的形成、重塑和稳定性中起着不可或缺的作用。细菌GH17 β-1,3-葡聚糖酶主要存在于海洋细菌中，对海洋天然碳资源（如昆布多糖）的分解和利用至关重要。β-1,3-葡聚糖酶的GH17家族由内切型和外切型酶组成。大多数特征性的GH17家族β-1,3-葡聚糖酶起源于植物，是发病机制相关蛋白。源自GH17家族的多种β-1,3-葡聚糖酶已在不同领域显示出多种潜在应用。细菌是工业酶的重要来源，具有良好的酶性能和稳定性。目前，缺乏针对细菌来源的GH17家族的β-1,3-葡聚糖酶的利用潜力和酶学特性的研究。因此，探索和鉴定源自细菌的新型细菌β-1,3-葡聚糖酶对于促进我们对GH17家族生理功能的理解至关重要。这种追求不仅对于推进β-1,3-葡聚糖酶在工业和食品领域的应用也非常重要，而且对于扩大其在其他领域的应用也非常重要。在这项工作中，编码源自拟杆菌属的GH17家族的β-1,3-葡聚糖酶的基因异源表达，并对产生的重组蛋白进行酶促表征。进一步探讨了细菌来源的GH17家族β-1,3-葡聚糖酶的催化特性、转糖苷活性和结构-功能关系。这些发现证实了该酶作为将天然β-1,3-葡聚糖转化为功能性寡糖的有前途的候选者的可行性。该研究发现BbGlc17A的催化特性不仅增加了我们对GH17家族成员的了解，还为拟杆菌属物种使用不可消化的多糖奠定了基础。
1.BbGlc17A序列分析
去除信号肽后，确定成熟的BbGlc17A蛋白有408个残基。理论分子量为46.8 kDa，pI为5.84。系统发育树分析（图 1A）表明，报道的17个成员的GH家族主要分为三个不同的组。Cluster A主要由来源于微生物的β-1,3-葡聚糖基转移酶（EC 2.4.1.-）、外切 β-1,3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.58）和内切β-1,3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.39）组成。据报道，Cluster A中的细菌成员在海洋β-1,3-葡聚糖代谢中发挥作用，而Cluster A中的真菌成员参与真菌细胞壁的形成、重塑和稳定性。作为聚类 A的一个亚分支，BbGlc17A与来源于福尔摩沙属的GH17家族β-1,3-葡聚糖酶FbGH17A的序列相似性为69.21%（PDBID:6FCG），表明BbGlc17A是GH17家族Cluster A内切β-1,3-葡聚糖酶。值得注意的是，GH17家族Cluster A的酶通常表现出非Leloir转糖基化酶能力，来自簇A的一些β-1,3-葡聚糖酶表现出很强的转糖基化酶活性。GH17家族的ClusterB和Cluster A主要包含植物发病机制相关蛋白，包括内切-β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）和内切-β-1,3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.39）。BbGlc17A与其他结构已知的GH17家族成员的氨基酸序列（图 1B）显示保存的谷氨酸充当催化成分。对于BbGlc17A，相当于亲核试剂的是Glu147，而质子供体是Glu283。图1. BbGlc17A序列分析。(A) BbGlc17A与GH17家族成员的系统进化树分析。GH家族17个成员的三个簇以不同的颜色显示。报告的每个成员的催化活性用ec数字表示。(B )GH家族17结构序列比对。用红点表示两个催化残基：Glu147和Glu283。蓝点用于识别关键的氨基酸残基。在红色背景上，相同的氨基酸残基以白色显示。使用MUSCLE进行序列比对，ESPript 3.0生成可视化序列比对图。
为了进行生化表征，将BbGlc17A的整个核苷酸序列克隆到pET28A载体中。大肠杆菌BL21（DE3）菌株有效地表达推定的β-1,3-葡聚糖酶基因（BbGlc17A）作为细胞内可溶性蛋白，带有N端His6标签。然后使用固定化金属离子亲和层析法纯化重组蛋白，其名称为BbGlc17A。考马斯染色的SDS-PAGE验证了重组BbGlc17A的>90%纯度，并显示分子量为46 kDa（图 2A），这与蛋白质的预期分子量一致。这种纯化的蛋白质现在可用于进一步分析酶的性质和表征。图2. BbGlc17A酶学性质分析。(A)纯化的BbGlc17A的SDS-PAGE分析。Lane M，蛋白质分子质量标记；Lane 1，裂解细胞上清；通道2，纯化酶溶液。（B−D）温度和pH对重组BbGlc17A活性和稳定性的影响。(B)最佳pH， (C)最佳温度，(D) pH稳定性，(E)热稳定性。对每个数据点给出三次测量的平均值±SD。以最佳条件下的酶活为100%活性值，确定相对活性。研究了pH对三种缓冲液(Tris - HCl缓冲液（●）、磷酸钠-柠檬酸缓冲液（▲）和醋酸缓冲液（■）的活性和稳定性的影响。以昆布多糖为底物，分析重组BbGlc17A的催化特性，以确定温度和pH值的影响。研究表明，该酶在pH值为6.5时效果最佳（图 2B）。该酶在中性条件下表现出更高的活性。在pH 6.0和pH 7.0时，酶活性分别为92.3%和87.3%。当pH值小于5或大于8时，酶活性降低至40%左右。重组β-1,3-葡聚糖酶在4.0–9.0的pH范围内表现出相对稳定的酶活性，酶活性水平保持在80%以上。然而，在酸性条件下酶的稳定性很差（图 2D）。同时，研究结果表明，在6.5的最佳pH值下，BbGlc17A的最佳温度被确定为30 °C（图 2C）。在25 °C和35 °C的温度下，酶活性保持在80%以上。 然而，该酶在超过70 °C的温度下活性急剧下降。BbGlc17A在20–40 °C范围内表现出良好的温度稳定性，其酶活性可以保持在90%以上。超过40 °C时，酶的稳定性迅速下降，在50 °C下孵育30分钟后观察到几乎完全失活（图 2E）。因此，在30 °C的最佳温度和6.5的pH值下，纯化的重组BbGlc17A对昆布多糖表现出约6.54 U/mg的比活性。关于底物特异性，BbGlc17A对昆布多糖表现出最高的酶活性，同时对可得糖表现出低水解活性，对酵母葡聚糖和其他葡聚糖没有水解活性（表 1）。通过酶实验证实了BbGlc17A中的两个催化残基（Glu147和Glu283），鉴定了突变体E147A和E283A中完全催化活性的丧失（表 2）。其他四种突变体（D225A、E333A、K336A和E345A）在不同β-1,3-葡聚糖底物（昆布多糖和凝乳聚糖）上也失去了完整的酶活性。这也表明氨基酸残基Asp225、Glu333、Lys336和Glu345也参与BbGlc17A的底物结合。随着反应时间的增加，重组BbGlc17A和昆布多糖之间的反应导致低聚合度寡糖的存在增加（图 3）。反应240分钟后，BbGlc17A成功将昆布多糖水解成昆布多糖（L3）、昆布四糖（L4）和昆布五糖（L5）。同时，BbGlc17A不仅具有水解活性，还具有很强的转糖基化活性，可产生一系列高聚合水平的复杂寡糖。这些不同的寡糖分散在TLC分析中（图 3）。BbGlc17A无法将昆布六糖、昆布五糖和昆布四糖水解成聚合度较小的寡糖，这表明BbGlc17A仅对β-1,3-葡聚糖或聚合度较高的寡糖具有催化活性。这一特性意味着BbGlc17A是一种非典型内型β-1,3-葡聚糖酶，可以水解昆布多糖并将其转化为寡糖，但不能转化为低聚合寡糖。此外，BbGlc17A具有独特的转糖基化活性，可实现一系列复杂的寡糖。图3. 水解产物的BbGlc17A分析。BbGlc17A水解昆布多糖(A)和昆布寡糖(B)的过程L2−L6分别为昆布二糖、海昆布三糖、昆布四糖、昆布五糖、昆布六糖；G，葡萄糖。底物分别为昆布多糖、L4、L5和L6。( C )利用MALDI - ToF MS对昆布多糖的水解产物进行分析。寡糖的单一同位素的钠加合物[ M + Na] +的质量由图谱中的峰所示。正如MALDI-ToF-MS分析所证实的那样，BbGlc17A的水解产物与昆布多糖的寡糖聚合度在3-8的范围内（图 3C）。此外，在MALDI-ToF-MS分析中检测到大量离子峰，表明BbGlc17A在昆布多糖水解过程中发生了转糖基化。核磁共振波谱是一种用于确定复杂碳水化合物结构的无损技术，可提供全面的信息，例如单糖的组成、α或β异头拓扑结构、连接模式和糖单元序列。在δC 102.86、102.79、102.79、102.76、102.57和102.49 ppm处鉴定出BbGlc17A对昆布多糖水解物的异头峰。源自α异头碳的信号通常在δC 95–101 ppm区域内检测到13C光谱，而大多数β异头碳的δC范围为101–105 ppm。这些NMR数据表明，水解产物由β-糖苷连接的寡糖组成。在13C水解产物的NMR谱图，信号分别出现在71.39、71.22和70.97 ppm处，表明水解产物由一定量的β-1,6-糖苷键组成(图 4）。102.86 ppm处的峰表明存在β-1,3-糖苷键。与未水解昆布多糖的13C NMR波谱显示，在71.39–70.97 ppm处出现峰，对应于新生成的β-1,6-糖苷键，这也表明转糖基化反应发生在BbGlc17A水解昆布多糖期间。图4. 水解产物的核磁共振光谱分析。(A)在D2O条件下，在600 MHz下记录laminarin底物的13C谱。(B)在600 MHz的D2O条件下记录了BbGlc17A水解产物的13C光谱。BbGlc17A的一般结构具有独特的(β/α) 8 TIM桶状折叠。这是对GH 17家族β-1,3-葡聚糖酶的诊断(图5A )。与其他典型的GH17家族酶相比，BbGlc17A具有较长的C端区域，形成了额外的亚结构域结构。此外，BbGlc17A在催化groove的糖基结合位点的非还原性末端和还原性末端有一些突出的loop区，这使得BbGlc17A的催化groove比其他典型的GH 17家族酶更窄、更长。分子叠加后，观察到底物分子深入BbGlc17A催化槽，与糖基结合位点紧密对齐（图 5B）。可以发现，BbGlc17A的催化沟揭示了至少8个糖基结合位点（-4至+4）。此外，底物和酶的结合主要通过氢键和疏水性糖结合平台实现。提出酶-底物的结合和随后的催化过程是由18个氨基酸残基发挥的重要作用介导的（图 5C）。BbGlc17A是一种糖苷水解酶。在BbGlc17A的催化过程中，既有水解反应，也有转糖苷反应（非Leloir转糖基化酶）。特别是，图5D显示了与代表性底物、受体和供体寡糖的化学式的转糖基化反应。图5. BbGlc17A的结构建模。(A) BbGlc17A的整体结构。带状图显示了BbGlc17A的整体结构，并显示了常规的（β/α）8 TIM-barrel。BbGlc17A与其他GH家族17酶的重叠用色带图表示，色带的颜色与每种酶相对应：BbGlc17A为蓝色，GluB20-2 （PDB代码：4GZI）为粉红色，RmBgt17A （PDB代码：4WTR）为沙子色。额外的环路区域以黄色突出显示。(B) BbGlc17A底物相互作用。β-1,3-寡糖配体由GH家族17酶复合物结构（PDB代码：4GZI和4WTR）叠加而成。每个叠加配体用一根棒子表示。(C)可能与底物相互作用的氨基酸位点。相互作用残基表见右图。蓝色表示BbGlc17A的氨基残基。红色标记对应两个催化残基。β-1,3-寡糖配体由GH家族17酶复合物结构（PDB代码：4GZI和4WTR）叠加而成。(D) BbGlc17A催化反应机理示意图。两个分支表示水解过程和转糖苷化过程的催化模式。
GH17家族的蛋白质在各种生物体中β-1,3-葡聚糖的消化和代谢中起着至关重要的作用。研究GH17蛋白质的组成和作用对于了解β-1,3-葡聚糖代谢酶的生理作用以及有效利用自然界中发现的β-1,3-葡聚糖资源至关重要。利用生物信息学方法对拟杆菌属（Bacteroidetes sp.）的GH17家族β-1,3-葡聚糖酶基因进行了推测。昆布多糖被BbGlc17A水解，得到聚合度为3 ~ 8度的寡糖。对BbGlc17A的水解产物进行分析，发现其不含葡萄糖，证实其不具有外显β-1,3-葡聚糖酶活性。这证实了BbGlc17A特有的内源性反应机制，它通过切割内部的β-1,3-糖苷键来破坏β-1,3-葡聚糖的糖链，导致β-1,3-寡糖的连续产生。令人惊讶的是，通过TLC和MALDI-ToF-MS分析，BbGlc17A具有独特的转糖苷活性，导致形成多种具有不同聚合度和糖苷键连接的新型寡糖。进一步对BbGlc17A的转糖苷活性进行核磁共振分析，发现水解产物的13C核磁共振谱显示，BbGlc17A在水解昆布多糖的过程中产生了新的β-1,6-糖苷键。文献中指出，某些糖苷水解酶也具有转糖基酶活性。其中包括许多GH家族17 β-1,3-葡聚糖酶，它们具有转糖基酶活性。序列进化树分析（图1A）揭示了一个有趣的观察结果，GH17家族成员具有转糖苷活性，特别是那些来自微生物的成员Cluster A，这与参与真菌细胞壁重组的β-1,3-葡聚糖代谢酶的生物学功能有关因此，GH17家族Cluster A成员可能由于其进化起源和功能适应而具有潜在的转糖苷活性。值得注意的是，细菌GH17家族β-1,3葡聚糖酶，特别是来源于海洋细菌的葡聚糖酶，通常被认为参与了海洋天然碳资源的分解和利用。拟杆菌衍生的β-1,3-葡聚糖酶的这种转糖苷活性的生物学意义尚不清楚。推测在Bacteroides PULs中，GH16家族β-1,3-葡聚糖酶（而不是GH17家族酶）主要负责海洋天然碳资源的降解和开发。通过对GH17家族Cluster A成员蛋白的结构分析，可以验证转糖苷活性的存在。与其他GH17家族酶相比，GH17家族Cluster A成员在催化槽的+1和+2亚位附近具有更高的芳香氨基酸残基。这些芳香氨基酸残基具有建立疏水平台，稳定转糖苷反应中间体，促进转糖苷反应正向发展的能力。BbGlc17A的独特结构特征，例如其较长的C末端区域，形成额外的亚结构域结构，以及在酶催化槽的糖基结合位点的非还原端和还原端都存在突出的环区域，导致BbGlc17A的催化槽比其他典型的GH17家族酶更窄、更长。突变实验表明，Glu333和Lys336在-2位置与糖残基形成氢键相互作用，而Glu345和Asp225分别在-1和+2位置与糖残基形成氢键相互作用（图 5C）。可以发现，BbGlc17A的催化沟至少有8个糖基结合位点（−4至+4），表明BbGlc17A的催化沟结构更适合结合长糖链。因此，酶性质分析表明，BbGlc17A对聚合度低于6的寡糖没有催化活性。图5C中列出了相互作用的残基列表，其中包含8个糖基结合位点（-4至+4）以及18个氨基酸残基。BbGlc17A和其他典型β-1,3-葡聚糖酶之间结构和酶学性质的差异强调了BbGlc17A在结合和加工较长的糖链底物方面的特殊性。探索β-1,3-葡聚糖酶的潜在应用，特别是在食品工业和农业中，具有重要意义。BbGlc17A是一种高度特异性的酶，对昆布多糖具有酶活性，对凝乳多糖活性低，对酵母葡聚糖和其他多糖无活性。酵母葡聚糖的结构由由β-1,3-糖苷键连接的主链和由β-1,6-键连接的分支组成，支链的空间位点电阻大。BbGlc17A对支链型葡聚糖没有活性。在自然状态下，凝结多糖会形成规则的三螺旋结构，这导致其水溶性低，也会影响凝结多糖被BbGlc17A水解。BbGlc17A（GenBank:NBC57610.1）的基因序列是在大盐湖微生物垫宏基因组的拟杆菌属细菌中发现的。昆布多糖是一种普遍存在的海洋微藻海洋储存聚合物。因此，BbGlc17A的生物学功能主要是参与拟杆菌属细菌对昆布多糖的利用，这是地球碳循环中的关键过程。酶学性质研究表明，pH 6.5和30 °C是BbGlc17A的最佳催化条件，由此得出BbGlc17A在部分中性和室温下具有最佳酶活性的结论。虽然BbGlc17A的最佳pH值与大多数β-1,3-葡聚糖酶的pH值一致，但其最佳温度低于大多数酶，并且在40 °C以下非常稳定。 例如，来自Agaricus brasiliensis的β-1,3-葡聚糖酶的最佳温度为45 °C，来自T. harzianum的β-1,3-葡聚糖酶的最佳温度为50-60 °C。功能性寡糖是功能性食品的极好基础。它们提供膳食纤维和益生元等好处来丰富饮食；改善肠道微生态，并具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎和降脂特性。目前，制备寡糖的两种主要方法是化学法和酶法。与化学法相比，酶法具有环保、无污染、产量高等优点。BbGlc17A为工业规模生产寡糖提供了宝贵的机会。本研究报道了来源于拟杆菌属的GH17家族β-1,3-葡聚糖酶BbGlc17A的表征，该酶是通过在大肠杆菌中重组表达获得的。重组BbGlc17A在pH 6.5和30 °C时表现出最佳酶活性。通过底物特异性分析，确定昆布多糖是BbGlc17A的首选底物。BbGlc17A水解昆布多糖生成昆布三糖、四糖和五糖；然而，该酶对聚合度小于6的昆布多糖没有水解能力。这种特异性归因于BbGlc17A与其他典型的β-1,3-葡聚糖酶相比，催化槽更长。BbGlc17A具有独特的转糖苷活性，使昆布多糖能够催化产生β-1,6-糖苷键，从而产生一系列高聚合度和多种连接形式的复杂寡糖产物。在本研究中，β-1,3-葡聚糖酶BbGlc17A中鉴定出这种独特的转糖苷活性，为混合糖苷功能性寡糖的特异性制备奠定了基础。
原文：Biochemical Characterization of a β-1,3-Glucanase fromBacteroidetes sp. Having Transglycosylase Activity Suitable to Synthesize β-GlucooligosaccharidesDOI: https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c08008
