《AEM》海洋细菌昆布多糖酶识别和催化底物的分子基础
文摘
科学
2024-12-15 14:03
江苏
2020年11月，来自中国科学院的Jian Yang等人在AEM上发表了一篇题为Molecular Basis for Substrate Recognition and Catalysis by a Marine Bacterial Laminarinase的研究性文章。
通讯单位：Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, Tokyo, Japan
Abstract
昆布多糖是一种丰富的藻类多糖，可以作为碳储存和燃料来满足异养微生物的营养需求。微生物胞外酶催化昆布多糖解聚启动再矿化，是海洋生物地球化学循环的关键过程。在这里，我们描述了一个来自海洋藻类的糖苷水解酶16 ( GH16 )家族昆布多糖酶生化和结构水平上的Flavobacteriia。我们发现内切酶优先裂解昆布多糖 β-1,3-糖苷键，并且在广泛的受体中表现出转糖基活性。此外，结构和诱变研究确定了酶和葡萄糖残基之间的多个特定接触，这对于 β-1,3-葡聚糖的底物特异性至关重要。这些结果为GH16家族昆布多糖酶的底物结合和催化的结构要求提供了新的见解，丰富了我们对细菌利用海藻昆布多糖的理解。重要性：异养细菌群落因其使有机碳再矿化的能力而成为海洋生物地球化学循环的关键参与者。复杂有机物的加工需要异养细菌产生具有精确特异性的胞外酶，将底物解聚至足够小的尺寸以供吸收。因此，细胞外酶水解启动微生物驱动的异养碳循环。在这项研究中，基于生化和结构分析，我们揭示了来自藻类相关海洋黄杆菌的昆布多糖酶对藻类碳储备β-1,3-葡聚糖的解聚机制。这些发现为细菌昆布多糖酶的底物识别和催化提供了新的见解，并促进更好地理解细胞外酶如何参与有机物循环。
海洋藻类的光合作用贡献了全球初级生产的一半。大多数固碳产物是聚合碳水化合物，最高可占藻类生物量的80%。海藻可以向藻圈环境分泌胞外多糖，吸引异养浮游细菌并满足其营养需求。海水中的高分子量溶解有机碳（HMW DOC；>1 kDa）通常占总DOC的15%至40%。因为细菌只能运输分子量<600 Da 的底物，HMW DOC 在摄取前需要被细胞外酶裂解。因此，细菌酶对藻多糖的分解是海洋碳循环中的关键过程。Flavobacteriia是与海洋藻类相关的最丰富的细菌群之一，它们的最高丰度通常出现在浮游植物水华的腐烂期，这表明它们在藻类生物量的利用中发挥了作用。对Flavobacteriia环境代表的基因组分析揭示了它们与生俱来的多糖分解代谢能力。Flavobacteriia基因组的一个独特特征是存在多糖利用位点 (PUL)，该位点协调参与复杂碳水化合物的检测、消化和运输的基因的表达。当遇到底物葡聚糖时，相应 PUL 的表达上调，并分泌糖苷水解酶 (GHs) 将葡聚糖解聚成更小的寡糖，然后由 SusCD 样复合物识别和导入。许多多糖降解酶来源于同时含有N端Sec和C端Por分泌系统型信号肽的Flavobacteriia由IX型sec输出。昆布多糖是一种可溶性 β-1,3- d-葡聚糖，具有有限的 β-1,6- d-分支，并参与大多数海洋藻类和浮游植物中存在的初级细胞内碳储存。据估计，海洋每年生产 5 至 150 亿吨昆布多糖。昆布多糖可以在藻类细胞裂解后以 HMW DOC 的形式释放到海洋环境中，并被远洋系统中的细菌胞外碳水化合物降解酶快速降解。昆布多糖酶 (EC 3.2.1.39) 主要是 GH16 的成员，水解昆布多糖中的内部 β-1,3-葡萄糖基键，从而在藻类有机碳的生物地球化学循环中发挥关键作用。 GH16 酶在海洋中的藻华中占主导地位并且与Flavobacteriia的峰值丰度一致，这一观察结果表明了昆布酶对环境的重要性。GH16 家族包括几种对藻类多糖具有特异性的酶，具有至少 11 个不同的已知 EC 编号，而昆布多糖水解被认为是 GH16 家族的祖先活性，并且与β-1，3-葡聚糖作为真核生物中碳储备的古老性质一致。对古细菌、放线菌和海洋细菌的 GH16 家族昆布多糖酶结构的分析表明，这些酶共享 β-果冻卷折叠并以保留机制催化糖基水解。在活性位点，一个谷氨酸残基作为亲核试剂攻击C1原子，另一个谷氨酸残基作为质子供体完成双置换机制。尽管昆布多糖酶催化作用已被广泛理解，但酶与底物/产物之间结构相互作用的细节尚未得到很好的表征。迄今为止，研究已经提供了GH16家族昆布多糖酶的酶-底物复合物结构，包括ZgLamA GH16（来自Zobella galactanivorans）与昆布四糖的复合物，ZgLamC GH16与硫代-β-1,3-六葡聚糖的复合物，和 Lam16A 复合β-1,4-葡萄糖基昆布二糖和 β-1,6-葡萄糖基昆布三糖。这些研究对 β-1,3-葡聚糖识别进行了概述，较少关注底物结合残基的构象变化或生化验证。本文通过对分离自中国南海红藻Amphiroa ephedraea（Lamarck）Decaisne的海洋黄杆菌Aquimarina sp. SCSIO 21287的昆布多糖酶的生化和结构分析，系统研究了昆布多糖解聚过程中酶的识别和加工过程。我们解决了昆布多糖酶及其失活突变体与活性裂缝中β-D-葡聚糖四糖复合的高分辨率晶体结构，从而鉴定了与β-1，3-葡聚糖底物特异性相关的结构特征。此外，定点突变和酶动力学分析进行了更深入的了解特定的酶-碳水化合物的相互作用。我们的研究表明：（i）昆布多糖酶选择性内切水解β-1，3-葡聚糖，同时具有转糖基酶活性，作用于一个独特的广谱受体，（ii）负亚位点的相互作用网络是底物选择性的原因，（iii）底物诱导的保守色氨酸残基构象的变化是催化过程中的一个独特特征。这些点提供了新的见解昆布多糖酶催化的分子基础，以及海洋细菌驱动的昆布多糖的生物地球化学循环。
1.功能模块的作用
来自Aquimarina sp. SCSIO 21287（LamAQ）的全长昆布多糖酶含有560个氨基酸残基和5个推定的模块，具有N-末端信号肽，随后是催化GH 16家族结构域、晶体接头肽、家族6的碳水化合物结合结构域（CBD IV）和C-末端PorSS尾（图1a）。为了研究每个模块的功能，我们异源表达并表征了LamAQ的四种截短形式，包括Lam560，Lam472，Lam348和LamCAT（图1b）。尝试生产全长酶，但没有成功。在这些衍生物中，在标准条件下，Lam560对昆布多糖的比活性为Lam472的0.11%，表明PorSS尾的抑制作用，其被进化枝Flavobacteriia的IX型分泌机制识别和切割。糖苷水解酶的非催化性碳水化合物结合模块通过选择性结合目标碳水化合物促进底物可及性以进行催化，这通过在其C末端具有CBD IV模块的Lam472的较高比活性证实（图1c）。.然而，我们观察到CBD IV模块降低了酶的温度适应能力。没有CBD模块的LamCAT和Lam348在20°C和90°C下分别显示出最大活性的约50%和30%（图1d），而Lam472在这些温度下几乎检测不到活性，并且具有显著降低的热稳定性（图1d和e）。为了测试酶的底物特异性，使用几种多糖作为底物，包括淀粉（β-1,4）、羧甲基纤维素（β-1,4）、大麦β-D-葡聚糖（β-1,3与β-1,4混合）、可德兰多糖（β-1,3;三螺旋）、酵母β-D-葡聚糖（β-1,3与β-1,6混合;不溶性）和昆布多糖（β-1,3;可溶性）。所有酶都选择性水解含有β-1，3-糖苷键的底物（图1c），对其他种类的多糖、淀粉和羧甲基纤维素没有可检测到的活性，表明对β-1,3-葡聚糖具有催化选择性。图1菌株SCSIO 21287昆布多糖酶的催化性质。(a)LamAQ功能单元的组织和本研究中分析的衍生蛋白的模块组成。该酶含有信号肽（SP;残基1至20）、GH 16结构域（GH 16;残基21至254）、结晶结构域（残基255至343）、碳水化合物结合IV型结构域（CBD IV;残基344至472）和Por分泌信号（PorSS;残基473至560）。(b)根据SDS-PAGE测得的截短LamAQ蛋白的纯度。(c)昆布多糖酶衍生物对β-1，3-葡聚糖的底物偏好性。(d)酶活性的温度依赖性。(e)昆布多糖酶衍生物在50°C的温度下的热灭活曲线。
以LamCAT催化域为模型酶，采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI TOF MS）和核磁共振（NMR）技术研究了昆布多糖的水解机理。昆布多糖水解产物的质谱显示寡糖的峰：m/z 527的昆布三糖+Na、m/z 689的昆布四糖+Na、m/z 851的昆布五糖+Na、m/z 1,013的昆布六糖+Na、m/z 1,175的昆布七糖+Na和m/z 1，337的昆布八糖+Na（图2a），三糖链的最终最小钠加合物峰，表明存在内溶机制。昆布多糖由20 - 30个葡萄糖单元组成，通过β-1，3-键和5%的β-1，6-键作为6-O侧支化链连接。为了证实-1，3-键的特异性，我们分析了昆布多糖和水解产物的1H NMR光谱，发现纯昆布多糖的1H信号的预期化学位移对应于4.52 ppm的β-1，3-D-吡喃葡萄糖连接的主链、4.36 ppm的还原末端和4.27 ppm的β-1，6侧链。将昆布多糖与LamCAT孵育后，我们观察到骨架信号显著降低，同时对应于昆布多糖降解后形成的还原末端的信号增加（图2b）。GH 16家族的昆布多糖酶以保留机制进行水解，并且可以潜在地表现出转糖基化活性，允许糖基残基从昆布多糖（供体）转移到含有羟基的分子（受体）而不是水。将LamCAT与昆布多糖和1 M甘油（作为替代受体）孵育，除了与水解相关的峰外，还产生了与甘油相关的新峰（m/z 601、763、925、1,087和1,249）（图2a）。有趣的是，LamCAT表现出出乎意料的广泛特异性与其他糖醇作为受体，包括乙二醇和木糖醇。尽管据报道GH 16家族的成员表现出转糖基酶活性，但很少有研究表明使用除葡糖基以外的广谱受体。酶的双功能特性使得精确的生理功能的鉴定变得复杂，但在寡糖合成领域有进一步研究机会。图2 LamCAT酶促产物的光谱分析。(a)LamCAT对昆布多糖水解和转糖基化产物的MALDI-TOF MS。指出了每个检测到的质量峰的分子量。加入不同的受体（终浓度，1 M）。为了阐明LamCAT底物特异性的分子机制，我们以1.54μm的分辨率解析了LamCAT的晶体结构。该结构在不对称单元中含有一个分子，属于C2221空间群，包括两个反平行的β-片层小叶，呈果冻卷拓扑结构，具有长环连接、分段的β-链和一个小螺旋片段（图3a）。在蛋白质的凸侧发现一个金属离子，并与Asp 245（主链和侧链）、Glu 30（主链）、Gly 68（主链）和一个水分子配位。这些残基是GH 16昆布多糖酶中保守的钙结合基序，除了来自Flavobacterium菌株UMI-01的ULam 111，其配位谷氨酸与组氨酸定位。H12 E的ULam 111突变导致更高的热稳定性，从而证实了钙在GH 16家族酶的稳定性中的重要作用。在LamCAT中也观察到钙离子对热稳定性的增强。我们清楚地观察到一个跨越300 nm的裂缝，由从β-链延伸的环连接。该裂缝含有残基Glu 135和Glu 140（图3a），它们在GH 16昆布多糖酶中高度保守，代表催化基序的一部分。用丙氨酸取代任何一个位点都可以使酶完全失活，这表明它在催化作用中的重要性。这两个活性羧基非常接近（约6.7μm），支持保留酶的空间需求。基于先前提出的催化机制，Glu 140质子化糖苷氧，伴随着β-1，3糖苷键的C-O断裂，而去质子化的Glu 135作为亲核试剂通过形成共价糖基-酶中间体来稳定共价糖基-酶中间体。使用底物类似物的捕获实验表明，共价中间体更可能在保留糖苷酶中形成。第二个去糖基化步骤涉及在Glu 140的共轭碱的辅助下攻击水分子，这使得游离糖保持其整体构型，并且酶返回其初始质子化状态。图3.LamCAT和寡糖复合物的结构。(a)LamCAT整体结构的功能区演示。催化残基Glu 135和Glu 140表示为红色棒。apo-E135 A（B）、E135 A-c3 g（c）和E135 A-lam 4（d）的催化空腔揭示了寡糖结合后的构象变化。为了阐明与LamCAT的β-1，3葡聚糖识别相关的机制，我们分别以2.21 nm和1.90 nm的分辨率测定了LamCAT的E135 A突变体（一种失活酶变体）与1，3-β-纤维三糖基-葡萄糖（c3 g）和昆布四糖（lam 4）复合的晶体结构（图3b至d）。LamCAT的E135 A突变体（一种失活酶变体）与1，3-β-纤维三糖基-葡萄糖（c3 g）和昆布四糖（lam 4）复合的L结构，分辨率分别为2.21 nm和1.90 nm（图3b至d）。这两种四糖通过从第二个到第四个葡糖基单元的不同糖苷键连接，对酶表现出不同的亲和力，lam 4和c3 g的KD（平衡解离常数）值分别为0.8 μ M和28.7 μ M（图4A和B）。每种蛋白质-碳水化合物复合物均显示出三个明确定义的葡萄糖基部分（亚位点E11至E13），而亚位点E14中的葡萄糖基单元始终显示出较弱的电子密度和较高的B因子值（图4C和D;表S2），这可归因于较少的蛋白质接触和增加的构象灵活性。在正亚位，没有观察到电子密度，并建立了一个明确的氢键网络所形成的一些被占领的水分子。所有葡萄糖基单元均为4C 1椅式构象，二面角分析显示两种四糖均接近全局能量最小值。载脂蛋白E135 A和复合物具有相同的骨架构象，总的C均方根偏差值为1.002μm。然而，酶-配体复合物具有明显扩大的配体结合催化裂缝，E135 A、E135 A-c3 g和E135 A-lam 4的空腔体积分别为240μ3、275 μ3和314 μ3。结构比较显示残基Val 128-Ala 133的底物诱导的结构变化。环移动反对配体形成开放状态的四糖住宿。在这些残基中，Trp 130形成最显著的取向变化，与两个结合的葡聚糖的亚位点β 2葡糖基单元相互作用，这可能是β-1,3-葡聚糖识别的关键结构特征。![]()
图4 LamCAT活性位点内的寡糖结合。（a和B）用lam 4（a）和c3 g（B）滴定的E135 A的等温滴定量热法（ITC）实验的结果。lam 4与E135 A的结合导致KD值为0.80 ~ 0.02 μ M，ΔH（焓变）为12.55 ~ 0.03 kcal/mol，Δ TΔS（熵变）为4.37 kcal/mol，N（位点数）为1.26 ~ 0.01。E135 A与c3 g的结合导致KD值为28.65 × 0.71μM，ΔH（焓变）为28.50 × 0.13 kcal/mol，Δ TΔS（熵变）为2.41 kcal/mol，N（位点数）为1.01 × 0.01。lam 4（c）和c3 g（d）的Fo-Fc省略图（1.5μπι）结合到LamCAT活性裂缝。酶-配体相互作用总结见图5和表S4。lam 4和c3 g的亚位点113和114中的葡糖基单元与酶的接触比亚位点111和112中的少得多，发现仅一个残基与Glc（113）和Glc（114）相互作用。lam 4和c3 g的Glc（-3）亚基分别与Asn 53和Asn 47形成水介导的氢键，而Glc（-4）亚基分别与Trp 130的主链NH基团通过水介导的氢键相互作用。这两个四糖的配体亚位点均通过β-1，3糖苷键连接，具有相似的构象;因此，可以认为与Glc（β 1）和Glc（β 2）相互作用的残基对酶的β-1，3糖苷键选择性至关重要。亚位点Glc（Gln 2）与残基Asn 52和Arg 88形成氢键，并与Trp 130进行疏水堆积。lam4的葡萄糖单元位于亚位点161处，通过各种相互作用进行配位，包括Asn52与O3和O4之间形成的氢键、Trp115与O6之间的水介导的氢键、His153与O1之间的盐桥、Tyr161与O2之间的水介导的氢键以及Asn221与O5之间的水介导的氢键。此外，我们观察到Asn52和Trp130都参与底物结合，分别作为与亚位点E1和E2以及亚位点E2和E3相互作用的桥梁。由于观察到Trp 130的吲哚基团的构象变化导致糖调节的催化裂缝扩大，堆积效应可能是底物结合所必需的。基于结构观察，可以推测LamCAT对β-1，3-葡聚糖的底物选择性与在几个底物口袋残基和β-葡聚糖之间形成的氢键和疏水堆积相互作用的网络有关。为了阐明活性口袋内的残基在催化中的作用，选择七个残基（Asn 52、Arg 88、Trp 115、Trp 130、His 153、Tyr 161和Asn 221）进行诱变。测定并比较野生型LamCAT及其变体对昆布多糖的动力学。我们首先为每个位点产生丙氨酸突变，这导致在所有情况下几乎检测不到对昆布多糖的活性（比活性为野生型LamCAT的0.1%）。然后，我们将残基突变为具有相似R基团结构的其他氨基酸（表1）。所有突变体对昆布多糖的催化效率（kcat /Km）降低了20- 1,000倍，表明所有研究的残基对β-1，3-葡聚糖识别和水解的重要作用。因此，这表明这些催化口袋残基对于昆布多糖水解进行了进化优化，这也得到了GH 16家族昆布多糖酶之间高度保守性的支持。在所有这些底物结合残基中，Trp 130因其显著的构象变化而被注意到，导致催化腔扩大。此外，Trp130可以促进底物定位以形成用于催化的有效米氏络合物状态，这通过其突变体的分析得到证实，突变体的kcat值显著降低了1,400倍。类似地，Arg88和His153与亚位点p12和p14的相互作用也可能影响底物定位而不是底物结合，因为它们的突变体的Km值基本不变。我们观察到，与O 6的葡萄糖基单元在subsite E111的残基相互作用是至关重要的底物结合，鉴于突变体W115 F和N221 L表现出7-和5倍的Km值增加，分别。这两个残基都通过水介导的氢键与位点相互作用，这是糖苷水解酶催化裂缝中的水网络通道的一部分，被认为控制底物偏好和活性。图5.亚位点101至104中的酶-碳水化合物相互作用。与lam 4（a）和c3 g（B）结合的Lam-E135 A的示意图。虚线和双箭头分别表示氢键和疏水堆积相互作用。介导氢键的水分子被描绘成灰色球。
表1.LamCAT及其变体对底物昆布的催化活性
GH17家族的蛋白质在各种生物体中β-1,3-葡聚糖的消化和代谢中起着至关重要的作用。研究GH17蛋白质的组成和作用对于了解β-1,3-葡聚糖代谢酶的生理作用以及有效利用自然界中发现的β-1,3-葡聚糖资源至关重要。海洋细菌酶作用下藻多糖的解聚是海洋有机物生态地球化学循环的基石。昆布多糖是海洋多糖的重要组成部分，但其水解机制还不清楚。本研究以藻类共生黄杆菌GH 16昆布多糖酶LamAQ为模型，探讨细菌水解海洋多糖的机理。与大多数具有单个催化结构域的细菌GH 16昆布多糖酶不同，LamAQ包含几个功能模块，包括N-末端信号肽、催化结构域、碳水化合物结合结构域和PorSS尾（图1a）。来自Bacteroidetes门成员的昆布多糖酶具有相似的多分子结构，其中C-末端PorSS结构域是唯一与IX型分泌相关的。有趣的是，我们发现PorSS结构域对昆布多糖酶活性表现出抑制作用，表明通过IX型分泌途径去除PorSS结构域是释放酶催化活性的必要成熟过程。仅在Bacteroidetes门中发现的C-末端PorSS作为外膜易位信号起作用，其被IX型分泌系统识别和切割，用于将蛋白质输出到细胞表面。LamAQ的N-末端信号肽似乎被Sec系统处理，穿过内细胞质膜到达周质，然后PorSS尾被分选酶切割，允许酶穿过外膜输出。因此，成熟形式的LamAQ可能在N-末端信号序列和C-末端PorSS尾中均不存在。GH 16是一个大而多样的糖苷酶家族，其采用紧凑的β-果冻卷折叠，并且通常对各种葡聚糖和半乳聚糖中的β-1，4-或β-1，3-糖苷键表现出活性。最近，通过大规模的序列和功能分析，GH 16家族成员被划分为23个亚家族，在CAZy数据库中的108，000个序列中检测到几种不同的活性。大多数GH 16成员，包括硫酸角质素内切-1，4-β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.39），昆布多糖酶（EC 3.2.1.103），内切-1，3（4）-β-葡聚糖酶（EC 3.2.1.6），地衣多糖酶（EC 3.2.1.73），琼脂糖酶（EC3.2.1.83），β-卡拉胶酶（EC www.example.com），木葡聚糖酶（EC 3.2.1.181），内切-β-1，3-半乳聚糖酶（EC www.example.com），β-紫菜多糖酶（EC 3.2.1.178），透明质酸酶（EC 3.2.1.35）和内切3.2.1.103）对植物和海洋多糖表现出GH活性。值得注意的是，一些GH 16成员，如酵母几丁质β-1，3/1，6-葡聚糖基转移酶（EC 2.4.1.-）植物木葡聚糖：木葡糖基转移酶（EC 2.4.1.207）和真菌外切-β-1，3-葡糖基转移酶/延长β-转葡糖基酶（EC 2.4.1.-）是参与细胞壁重塑的主要转糖基酶。GH 16酶是保留酶，其分别在水解或转糖基化反应期间通过将糖基转移至水或碳水化合物受体来利用共价糖基-酶中间体的分解。在本研究中，我们发现LamCAT显示出与作为受体的广谱糖醇的糖基转移酶活性（图2a），这使其根据其将β-1，3葡聚糖衍生物掺入不同糖受体的能力而成为用于合成多种寡糖的有前景的酶。据我们所知，尽管在其他GH家族的一些碳水化合物水解酶中观察到类似的结果，但以前在GH 16家族成员中没有报道过这种独特的特征。复杂碳水化合物的体外合成对于糖科学的基础研究和具有商业价值的产品的制备具有相当重要的意义。与使用核苷酸糖作为供体底物的糖基转移酶相比，保留GH更稳定，并且具有更广泛的底物特异性。因此，这些发现表明在未来的研究中工程改造LamCAT以抑制水解酶活性和增强转糖基酶活性的潜在益处。昆布三糖是LamCAT水解海带多糖的最小产物，我们期望使用四糖共结晶来捕获跨越阴性和阳性亚位点的寡糖底物的结构。然而，电子密度没有观察到在积极的亚位点，和四个葡萄糖部分的四个四糖在亚位点-1至-4建模。Aurore等人还尝试用ZgLamCGH16结晶六糖，这导致正亚位点中的电子密度过于无序，无法建模为糖单元，表明正亚位点中的结合亲和力较弱。事实上，在GH16家族酶的复杂结构中很少观察到阳性亚位点的寡糖。先前的研究表明，在亚位点B1中糖单元的扭曲的斜船构象导致离去基团的优选轴向取向，使得难以获得负和正亚位点的同时占据。在本研究中，我们发现lam4和c3g的亚位点p111上的吡喃葡萄糖环与两个保守的Trp115和Trp119平行。β 1葡糖基单元的位置与ZgLamAGH16和Lam16A中报道的位置相似，而ZgLamCGH16中的葡萄糖由于与O6的氢键较少而与相应的芳香族残基Trp117和Trp121垂直结合。载脂蛋白和复合酶之间的结构比较揭示了一个扩大的催化腔的LamCAT寡糖结合。虽然在GH16_3昆布多糖酶的成员中没有观察到从“闭合”到“打开”状态的转换，但据报道，GH16_17卡拉胶酶PcCgkA的催化通道在底物存在下采用“闭合”构象。在促进开放态催化裂缝的移位环（Val 128至Ala 133）中，Trp 130的吲哚环通过与β 2葡萄糖基单元的堆积相互作用经历了显著的构象变化。LamCAT中的Trp 130是保守序列“WPA”的一部分。WXX..GH16_3亚家族中的“WPX”（对于第二基序，X代表M或L，对于第三基序，X代表A、K、R、M或L），其成员都可以识别β-1，3-葡聚糖。我们随后通过诱变和酶动力学分析证实了Trp130在催化中的作用（表1）。先前已在昆布多糖酶中报道了由色氨酸残基与-2葡萄糖单元相互作用诱导的疏水平台。尽管如此，ZgLamAGH 16和ZgLamCGH 16（载脂蛋白和复合结构两者）中的色氨酸均未表现出类似的构象转变，并且开-闭结构转变可能与LamCAT不同。另外两个保守的色氨酸残基（Trp 115和Trp 119）与亚位点GH 16昆布氨酸酶中的底物结合也有关。这些发现支持了位于负亚位点环中的色氨酸残基具有功能和进化重要性的前提。总之，我们的研究提供了一个深入的结构和功能的GH16家族昆布多糖酶在细菌降解或海洋生物质中的多糖重塑。结构和生物化学发现表明，由来自海洋黄杆菌SCSIO 21287的昆布多糖酶LamCAT催化的β-1，3-葡聚糖解聚和转糖基化的最新催化机制（图6）。解析的结构允许首次报告的可视化的构象变化LamCAT后，β-1,3-葡聚糖结合，以及底物的选择性。此外，结构分析，诱变和动力学研究提供了新的见解残基形成一个扩展的底物结合裂缝。此外，检测到的转糖基酶活性和独特的广谱受体揭示了酶的活性寡糖和糖缀合物合成的潜在利用。图6海洋细菌昆布多糖酶LamCAT的水解/转糖基机制示意图。活性残基Glu 140使糖苷氧质子化并断裂昆布多糖的β-1，3糖苷键（左上），产生氧碳正离子中间体，该中间体通过与亲核体Glu 135产生共价糖基-酶复合物来稳定（左下）。然后通过在水解或转糖基化反应期间分别将糖基转移到水或碳水化合物受体来分解共价中间体（右下）。供体-受体结合从催化裂缝释放生成的产物（右上）。酶的受体可以是水、乙二醇、甘油、木糖醇或木糖醇。在β-1，3-葡聚糖结合时，催化裂缝通过开放状态构象容纳底物。
原文：Molecular Basis for Substrate Recognition and Catalysis by a Marine Bacterial LaminarinaseDOI: https://doi.org/10.1128/AEM.01796-20
