2024年第 8 期封面
Niu, H., Gu, J. & Zhang, Y. Bacterial persisters: molecular mechanisms and therapeutic development. Sig Transduct Target Ther 9, 174 (2024). https://doi.org/10.1038/s41392-024-01866-5
浙江大学张颖教授和浙江中医药大学牛红霞副教授合作，于2024年7月17日在Signal Transduction and Targeted Therapy发表封面文章“Bacterial persisters: molecular mechanisms and therapeutic development”。本文全面总结了持留菌的历史背景，详细介绍了持留菌的复杂特征及其与耐药菌的关系，系统阐明了多种持留菌形成的机制和通路，同时总结了抗持留菌的药物及化合物和治疗方法的研究进展，并针对更有效地治疗临床上难以治疗的持续感染和生物膜感染提出了新的思路和见解。
1.持留菌的研究背景
细菌感染长期以来一直是人类的困扰。在过去的一个世纪中，抗生素的发现和广泛使用极大地改善了这些感染性疾病的治疗效果，拯救了无数人的生命。然而，在近年来，抗生素耐药菌，尤其是“超级耐药细菌”的出现和日益增多，引发了人们对耐药菌感染治疗的担忧，更是提示我们正在进入一个对细菌感染治疗日益无效的时代。除了抗生素耐药菌，处于低代谢或冬眠状态的对抗生素耐受的持留菌在临床上可引起持续性感染，是细菌感染面临的另一个重大挑战和难题。
持留菌最早是在上世纪40年代随着青霉素的使用而被发现的，但被发现后的几十年，其临床重要性并没有得到广泛认同和重视。近年来，随着人们对持留菌与持续感染和生物膜感染相关性认识的不断增加，持留菌发生机制及治疗的研究受到越来越多的关注。
2.持留菌概念及特征
持留菌（Persisters）是在抗生素暴露等应激条件下仍然能够存活的不繁殖或繁殖缓慢的休眠或低代谢的细菌。持留菌具有在抗生素存在的情况下存活的能力，但它们与耐药细菌不同，比如在抗生素去除后可以恢复繁殖能力，并且仍然对相同的抗生素敏感。持留菌对抗生素具有强大的耐受性，并表现出多药耐受性（multidrug tolerance, MDT）。持留菌对抗生素的耐受性仅表现在表型水平上，与由基因突变或抗生素耐药基因引起的抗生素耐药菌不同。
持留菌还具有表型异质性。比如，代谢水平多样性，表现在有的持留菌代谢停滞、有的持留菌代谢缓慢；持留能力的不同层次，有的持留菌持留能力强（deep persistence），有的持留菌持留能力弱（shallow persistence），甚至有存活但不可培养的（viable but non-culturable, VBNC)更深层次的持留菌；持留菌可有菌落大小的差异，比如小菌落变种（small colony variants，SCVs）持留菌的出现。此外，持留菌还具有相对性，即持留菌的持留能力是相对的，并且高度依赖于细菌的代谢状态、使用的特定抗生素及其浓度和作用时间以及环境条件等。本综述对持留菌的这些复杂特性进行了系统的分析和总结，并提出了药物敏感细菌、持留菌和耐药菌在宿主感染过程中同时共存并可以动态相互转化（图1）。
图1. 在宿主感染过程中，持留菌、敏感细菌和耐药细菌的共存和动态转换过程。
3.持留菌的临床意义
持留菌的发现已经有80多年的历史，但是直到抗持留菌结核药物吡嗪酰胺（pyrazinamide, PZA）的临床效果和作用机制被证实后，持留菌的重要性和意义才被逐渐接受和认同。早在1950s，PZA就被发现，在小鼠模型中可缩短结核疗程和降低复发率方面起着至关重要的作用，后来临床研究证实其使用可将原来9-12个月的结核疗程缩短至6个月，在临床得到广泛应用。随后，我们课题组通过多年系统研究发现PZA主要靶向持留菌及持留相关通路的机制，而对代谢活跃的细菌没有作用。由此，持留菌的临床意义及抗持留菌药物的重要性被首次建立并证实。
近年来，持留菌已在几乎所有病原体中被鉴定出，包括细菌、真菌和寄生虫。虽然许多研究发现持留菌与慢性持续性感染如尿路感染，结核，布病，支原体和衣原体等感染的复发、生物膜感染及耐药的产生等临床难题密切相关，是感染性疾病有效治疗的重大挑战，但直接证据往往不充足或不容易提供。随着杀灭持留菌的药物和药物组合被发现并在临床上可以真正改善或治愈持续性感染和生物膜感染的治疗，持留菌在不同感染中的重要性会逐渐被认可（见如下：杀灭持留菌的化合物，药物及药物组合研究）。
4.持留菌形成与存活的分子机制
由于持留菌的复杂特性，如异质性、相对性、瞬时性、数量稀少，研究其形成和存活的分子机制具有很大的挑战性。本综述中，我们总结了与持留相关的具体基因和通路，主要包括毒素-抗毒素模块(toxin-antitoxin module, TA module)（图2）、能量代谢（图3）、嘌呤和氨基酸代谢、代谢调节、反式翻译和蛋白质降解系统、SOS和sigma因子RpoS介导的应激反应、群体感应和信号传导系统、严谨反应和鸟苷磷酸（ppGpp）（图4）、DNA修复和保护系统、外排泵/运输系统、DNA/RNA的甲基化和乙酰化等表观遗传修饰、RNA降解和非编码小RNA调节等。
图2 细菌通过TA模块形成持留菌的机制。II型 TA模块的抗毒素通常是由蛋白酶ClpP或Lon在响应ppGpp信号时降解的蛋白质。这些毒素通过干扰DNA旋转酶、作为mRNA内切酶、使谷氨酰-tRNA合成酶（GltX）失活和乙酰化-tRNA等方式，介导细菌进入持留状态，破坏复制和翻译过程。I型 TA模块的抗毒素是由“SOS”响应和ppGpp信号激活的反义RNA。这些毒素通常是小蛋白质，插入并在细菌膜中形成孔道，导致质子动力驱动力（PMF）和ATP产生的丧失。
图3 通过能量代谢形成持留菌的机制。持留菌的代谢活性低于非持留菌，这种降低的能量代谢活性可能通过(a) 甘油三磷酸代谢、(b) 好氧呼吸、(c) 三羧酸循环和(d) 甲基柠檬酸循环（MCC）介导，这可能使持留菌进入休眠状态并在恶劣条件下存活。例如，降低的ATP水平降低了ATP依赖性抗生素靶标的活性，而降低的质子动力驱动力（PMF）限制了氨基糖苷类抗生素等抗生素的进入，从而增强了耐受能力。
图4 通过SOS响应、严格响应和群体感应形成持留菌的机制。SOS响应是由DNA损伤触发的，促进遗传修复以增强细胞在应激条件下的存活。它还有助于激活类型I TA模块TisB/IstR。严格响应是对营养匮乏或限制（如碳、氨基酸氮和磷）的全局响应，其中ppGpp是一个重要的信使分子。该响应通过涉及TA模块和核糖体的下游途径诱导细菌休眠。群体感应是一种基于细菌群体密度协调行为的细菌通讯过程。细菌释放信号分子（AHL、CSP、吲哚等），这些信号分子可以增强外排泵或干扰代谢。
5.杀灭持留菌的化合物，药物及药物组合研究
持留菌不仅阻碍了我们有效治疗感染的能力，还充当了抗生素耐药菌的储存库。因此，在面对慢性持续感染带来的挑战时，包括复发感染、细菌耐药和生物膜形成，杀灭持留菌对于改善治疗效果至关重要。然而，临床常用的抗生素主要杀灭生长的细菌，对持留菌的活性较差。因此，慢性持续感染和生物膜感染的治疗变得异常具有挑战性，导致治疗结果不尽如人意。令人鼓舞的是，随着人们对持留菌机制和特征的理解不断深入及药物筛选，已经发现了几种抗持留菌化合物。本综述对这些化合物总结为三类，包括直接杀灭持留菌、使持留菌对传统抗生素更敏感以及抑制持留菌形成。
对于持续感染的药物组合治疗方案最早追溯到1950s，即PZA参与抗结核病药物联合方案的临床应用。联合PZA的药物组合方案，对结核病这一具有挑战性的持续感染的临床治疗效果显著，也为治疗其他持续感染提供了范例。近年来，多个课题组致力于发现和评价不同的药物组合方案对持留菌引起感染的治疗作用，但是这些药物组合主要在体外模型进行评估，而且充满了挑战和不确定性。少数杀灭持留菌的药物组合虽在有的动物模型上，比如，ADEP4+利福平（RIP）、氨基糖苷类抗生素+糖等抗持留菌的组合有活性，但在其他动物模型研究中并没有活性。因此，有必要寻找可以有效杀灭持留菌并治愈持续感染的合理药物组合。我们课题组，根据PZA杀灭持留菌的原则和先前提出的持留菌“阴阳模型”构建了多个杀灭不同细菌持留菌的药物组合，并在体外和物模型进行了有效性的研究。比如针对伯氏螺旋体感染的头孢哌酮+多西环素+达托霉素组合；针对铜绿假单胞菌感染的克林沙星+头孢呋辛+庆大霉素组合；针对金黄色葡萄球菌感染的克林沙星+美罗培南+达托霉素组合等，均达到了“proof of principle”的验证。当然，这些药物组合还需要进一步的临床验证以确定其是否可以根除相应的持续感染。在本综述中，我们提出了可能有效的药物组合方案并进行了论述（图5）。
图5.治疗持续感染的药物组合策略。（1）结合杀死代谢活跃细菌和持留菌的药物。（2）结合持留菌恢复药物敏感性的化合物与传统抗生素。（3）组合作用靶点和机制不同的药物。（4）结合抗菌剂和调节宿主免疫的免疫调节剂。
6.总结和展望
在这篇综述中，我们全面总结了持留菌的历史背景，详细描述了持留菌的复杂特征，并探讨了持留菌的耐受性和细菌耐药的关系。此外，我们系统地讨论了持留菌的形成机制和通路，整合了迄今为止发现的多种抗持留菌的化合物、药物和药物组合。然而，关于持留菌的分子机制和治疗策略仍存在许多未解之谜，需要进一步研究和探讨。同时，持留菌与其相关的慢性持续性感染和自身免疫(如类风湿关节炎，系统红斑狼疮，IgA肾病等）、肿瘤以及病因不清的疾病（如Alzheimer’s的发生和发展）的关系值得进一步探讨。展望未来，杀灭持留菌的药物及治疗方法的研发和应用对临床上的难治的持续感染和生物膜感染地有效治疗具有重要意义。预期在不久的将来人们会越来越重视持留菌的研究，其研究可能引起慢性持续感染和生物膜感染及其相关疾病治疗方面的创新和革命，有希望使临床上一些难治的复发的感染（如复发性尿路感染等）或相关疾病得到真正的改善或治愈。
通讯作者 张颖教授
张颖，教授，博士生导师，原约翰霍普金斯大学终身教授，2020年加入浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室。长期从事细菌耐药和持留的研究，是全球结核耐药及细菌持留领域的开拓者和领军人物。先后在Nature、Nature Medicine、Science、STTT 等重要刊物发表SCI论文300余篇。
第一作者 牛红霞副教授
牛红霞，博士，副教授，硕士生导师。入选甘肃省“青年科技人才托举工程”。主要从事细菌持留机制及持续感染的中西医防治研究。主持国家自然科学基金，作为项目骨干成员参与国家863计划、重大传染病防治科技重大专项、“病原学与防疫技术体系”国家重点专项等重大科研项目。以第一作者或通讯作者在STTT，Emerg Microbes Infect, Int Immunopharmacol, Vaccine等国际刊物发表多篇研究论文。
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