STTT封面文章丨FGF7促进ACE2在胰岛类器官的表达

广州国家实验室及广州医科大学刘会生/徐涛/赵金存团队于2024年4月23日在Signal Transduction and Targeted Therapy发表封面文章 “FGF7 enhances the expression of ACE2 in human islet organoids aggravating SARS-CoV-2 infection”。研究团队利用胰岛类器官、临床样本和小鼠模型，系统研究了新冠感染下FGF7上调ACE2在胰岛（尤其是β细胞）中表达水平以及加重新冠对胰岛的侵染。

研究背景与意义

由于SARS-CoV-2变体不断出现，COVID-19的预防和治疗仍然存在巨大挑战。然而无论病毒如何变异，SARS-CoV-2的刺突蛋白（spike）与原代宿主细胞膜受体血管紧张素转换酶2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)的相互作用对于新冠病毒与宿主细胞表明结合和进入宿主细胞都是不可或缺的。因此，ACE2高表达的组织比低表达的组织更容易感染新冠病毒。降低ACE2表达是阻碍SARS-CoV-2与宿主细胞结合的有效策略，此方法不会因为新冠变异株的出现而影响其疗效。一些小分子和FDA批准的药物，如短链脂肪酸(SCFAs)、熊去氧胆酸(UDCA)、UDCA联合双氢青蒿素(DHA)、皮质类固醇和丙酸氟替卡松，已被报道通过降低不同细胞、组织和器官中ACE2的表达来预防SARS-CoV-2感染。因此，发现新的调节ACE2表达的调控因子对开发治疗COVID-19的药物和疫苗具有重要意义。

成纤维细胞生长因子(FGFs)通过与FGF受体(FGFR1、2、3和4)结合，控制细胞增殖、炎症、血管生成、组织修复和再生。在生理状态下，FGFs稳定储存在细胞外基质(ECM)储存库中，其释放受到严格调节。然而，在COVID-19的背景下，蛋白酶释放ECM结合的FGFs参与炎症和血管生成依赖性疾病相关的病理生理过程。最近的研究表明，FGFs加重新冠病毒对宿主的感染能力，用多贝酸酯抑制FGFRs可改善COVID-19患者白肺和依赖氧气的症状。此外，FGFs和ACE2之间的相关性也已经被少量报道。例如，在啮齿动物模型中，FGF21和FGF23已被证明可以调节ACE2酶活性和基因表达水平。FGFs不同亚型在人体组织中分布不均，其中FGF7在胰腺发育、再生和植入胰岛存活中起着至关重要的作用。在COVID-19患者中，特别是合并糖尿病的患者中，FGFs对胰岛ACE2表达的潜在调节作用以及该过程在胰岛功能和病毒感染中的作用尚不明确。

越来越多的证据表明，与未感染新冠的个体相比，COVID-19患者出现新发糖尿病的人数明显更多。进一步研究表明，SARS-CoV-2可以通过ACE2直接感染胰岛β细胞，损害其胰岛素分泌能力。在COVID-19大流行开始时，研究人员普遍担心由于抗糖尿病药物可以增加ACE2的表达和活性，该类药物的使用可能会增加糖尿病患者新冠感染的风险。然而，回顾性临床研究并未发现这些降糖药物使糖尿病病人合并COVID-19感染的预后比未服用降糖药的患者更差。这也许是由于ACE2在胰岛中发挥了双重功效，一方面ACE2可以作为病毒结合受体，另一方面ACE2可以改善胰岛素分泌，并具有抗氧化和抗炎作用。大多数关于ACE2-Ang(1-7)通路对β细胞功能和胰岛素分泌的调节作用是通过动物模型和β细胞系实验中总结得到的。目前还缺乏对人胰岛内，特别是β细胞中ACE2水平变化在SARS-CoV-2感染期间对β细胞功能和病毒感染意义的系统研究。

综上所述，本研究利用hESC衍生的胰岛类器官、动物模型和COVID-19患者血清样本来阐明FGF7对胰岛内ACE2水平的调节作用，及其对胰岛素分泌和SARS-CoV-2感染的影响。

研究结果

1. 胰岛发育过程中ACE2的动态表达

参考几篇高影响力胰岛类器官分化方案，本研究在人胚胎干细胞分化胰岛类器官过程中的原肠管期(S2, 50 ng/mL)、胰腺前肠期(S3, 50 ng/mL)和胰腺内分泌期(S4, 2 ng/mL)添加了FGF7 (图1a)。精确调节FGF7浓度和持续时间对于胰腺谱系发育和模拟体内胎儿胰腺发育至关重要。在胰岛类器官分化过程中，FGF7是否能诱导和调节ACE2的表达尚未研究。因此，我们首先分析了在hESCs向胰岛类器官分化过程中ACE2表达的动态轨迹。结果显示，ACE2的基因和蛋白水平在胰腺内分泌祖细胞（S5）和成熟胰岛类器官（S7）中的表达量最显著（Fig 1b、1c和1d）。染色结果显示ACE2在发育过程中表达量非常低，直到胰腺内分泌祖细胞（S5）阶段染色阳性比例大幅增加，并且部分和PDX1阳性细胞共染，说明ACE2阳性细胞包括胰腺内分泌祖细胞和非内分泌杂细胞（Fig 1e）。非成熟胰岛类器官（S6）和成熟胰岛类器官（S7）染色结果显示ACE2 在S6阶段表达量低，随着胰岛发育和成熟，ACE2在S7中的表达量显著增加（Fig 1f）。

2. ACE2主要在β细胞中表达，而在α和δ细胞中表达较少

为了研究ACE2在胚胎干细胞来源的胰岛(α、β和δ细胞)中的共定位，我们在S6和S7获得的胰岛类器官中对ACE2和GCG、INS和SST进行了共染色(图1f)。在S6时，ACE2在7.7±2.6%的GCG+细胞、14±4.3%的INS+细胞和1.8±1.6%的SST+细胞中表达。随着S7中胰岛类器官的成熟，ACE2阳性细胞的比例分别增加到GCG+细胞为20±7.4%，INS+细胞为73±10%，SST+细胞为2.9±1.2%(图1g, S7)。结果显示ACE2共定位在β细胞中最高，在α细胞中中等，而在δ细胞中较低。

进一步我们用CD26和CD49a磁珠分选出纯化的α细胞、β细胞，通过荧光染色和免疫蛋白印迹法，进一步证明ACE2主要表达在β细胞，而少量表达在α细胞和δ细胞（Fig 1h、1i和1j）。非胰岛内分泌杂细胞（α-β-）中ACE2表达量也较高，在本文中未做进一步研究（Fig 1j）。

3. FGF7主要通过FRFR2受体调节胰腺祖细胞中ACE2的表达

基于胰腺发育过程中FGFR2和ACE2轨迹中观察到的平行模式（Fig S1b和S1c），我们假设FGF7-FGFR2信号传导与ACE2表达之间存在潜在相关性。为了研究这种可能的相关性，FGF7(图2a, G2组)及其受体FGFR抑制剂(FGFRi, PD166866和alofanib;图2a, G3组)加入胰腺祖细胞培养液中，未处理细胞作为对照(G1)。我们的研究结果显示，暴露于FGF7后，内分泌祖细胞中ACE2的基因和蛋白水平均显著增加(图2b和c)。为了确定受FGF7诱导的ACE2上调影响的特定细胞类型，我们将ACE2(绿色)与阶段特异性标记PDX1(红色)共同染色(图2d)。结果显示与未处理的对照组相比，ACE2+细胞数量显著增加(图2e, P<0.05)。此外，FGF7处理显著增加了PDX1+细胞中ACE2+细胞的百分比，从20%增加到55%(图2f, P<0.05)。综上所述，我们的研究结果表明FGF7参与了内分泌祖细胞（特别是在pdx1阳性内分泌祖细胞)中ACE2表达的上调。

组学数据显示（图2g-l），在FGFR被抑制剂阻断后，差异基因主要富集在胰腺功能障碍相关通路、糖尿病并发症、MODY和胰腺分泌等。这些发现提示FGF7-FGFR2通路在胰岛发育和功能中起关键作用，抑制FGF7-FGFR2通路可能增加糖尿病相关疾病的风险。总之，FGF7主要与FGFR2结合从而上调胰腺细胞中ACE2的表达。然而，连接FGFR2和ACE2的下游通路的确切机制尚不清楚，需要在未来的研究中进一步研究。

4. FGF7调节胰岛类器官（尤其是β细胞）中ACE2的表达

为了进一步研究FGF7对成熟胰岛(模拟成人胰岛)中ACE2表达的影响，从S7D7到S7D14持续给药FGF7和FGFR抑制剂(图3a, G4和G5组)。用FGF7 (G4组)处理的胰岛类器官，ACE2在基因(2.5倍，图3b)和蛋白(4倍，图3c)水平上显著增加。与我们在内分泌祖细胞中的观察结果相似，FGFR1和FGFR2抑制剂的联合使用有效地抵消了FGF7诱导的胰岛类器官中ACE2的上调。S7D14胰岛类器官冷冻切片的IF染色(图3d)显示，G4中ACE2阳性细胞的百分比(42.7%)明显高于G1(26.7%)(图3e)。添加FGFR抑制剂可显著降低胰岛类器官中ACE2阳性细胞的百分比。磁珠分选法分离出纯化的α和β细胞与胰岛类器官相比，消除了杂细胞的影响，可以更直接地观察FGF7和FGFR抑制剂对这些细胞内ACE2的影响。IF共染色显示，在FGF7处理后，纯化的α和β细胞中ACE2的荧光强度(FI)大幅增加(图3f-h)，而这种增加被FGFR抑制剂有效地抑制。WB分析显示，在纯化的α和β细胞中，FGF7显著上调ACE2(图3i-k, G4组)。总的来说，与G1细胞相比，在FGF7处理的G4细胞中，α细胞中ACE2的表达平均增加约2倍，β细胞中ACE2的表达平均增加7倍。从IF和WB结果来看，FGFR抑制剂显著降低纯化α和β细胞中ACE2的表达(图3f-k, G5组)。我们在纯化的α和β细胞中检测了FGFRs的基因表达，FGFR2和FGFR1在这两种内分泌细胞中都有显著表达。FGFR1的表达是相似的，而FGFR2在β细胞中的表达远高于α细胞。因此，我们假设FGFR2表达水平越高，ACE2表达水平越高，对FGF7的刺激越敏感。综上所述，FGF7和FGFR抑制剂主要增强ACE2在β细胞中的表达，适度影响α细胞。

 5. FGF7通过调节ACE2的表达量和活性来调节胰岛功能

ACE2是SARS-CoV-2的重要受体，也是一种对胰岛素分泌和β细胞功能特别重要的酶。在FGF7处理的类器官中，与对照组相比，ACE2活性增加了1.5倍(P<0.05)，并且这种增加被FGFR抑制剂抑制(图31和m)。这一发现表明FGF7诱导的ACE2积累也导致ACE2活性增加。随后，我们评估了暴露于FGF7和FGFR抑制剂的hESC来源的胰岛类器官对葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能。对照组在16.7 mM葡萄糖处理后的胰岛素分泌量比2.8 mM葡萄糖处理后的胰岛素分泌量高1.3倍(图3n，黑色)。有趣的是，FGF7治疗增加了胰岛素对高糖的反应（1.6倍，图3n，蓝色)。然而，在FGFR抑制剂的存在下，胰岛类器官中的ACE2活性被逆转，对高糖刺激未增加胰岛素分泌(图3n，紫色)。这些结果表明，在高糖条件下，FGF7促进β细胞中ACE2的表达刺激了胰岛素的分泌。FGF7和FGFR抑制剂影响胰岛素分泌的潜在机制和下游途径以及不同条件下存在的内分泌细胞数量需要进一步研究。综上所述，我们的研究结果表明，FGF7处理导致产生内分泌激素的细胞(主要是β细胞)中ACE2表达和活性增加，进而增强胰岛素在高糖下的释放。相反，FGFR抑制剂会降低ACE2的表达和活性，从而损害胰岛类器官的胰岛素分泌。总之，我们的研究阐明了FGF7-FGFR通路在调节人胰岛类器官ACE2表达和胰岛素分泌中的作用。然而，在SARS-CoV-2感染期间，FGF7-FGFR通路激活诱导的ACE2上调是否有利于胰岛素分泌或可能促进病毒感染仍不确定，我们将在下一节进行详细阐述。

6. FGF7加重SARS-CoV-2病毒感染胰岛类器官，这种作用可以被FGFR抑制剂抵消

感染SARS-CoV-2活病毒前，先用FGF7和/或FGFR抑制剂预处理胰岛类器官3天，以提前激活或抑制FGF7-FGFR通路，感染SARS-CoV-2病毒2h后，洗掉未感染的病毒粒子，继续培养72h后，收集胰岛类器官和上清样本进行进一步分析(图4a)。QPCR结果显示72hpi后，G4胰岛类器官细胞内和上清样品中的病毒RNA水平高于G1类胰岛器官(图4b和c)。用FGFR抑制剂治疗导致类胰岛器官和上清中病毒RNA的减少，与G1类胰岛器官中观察到的水平相当(图4b和c)。随着时间的推移，FGF7似乎增强了胰岛类器官内的病毒量，并随着时间的推移，病毒释放到上清中。而FGFR抑制剂有效地阻止了24hpi和72hpi之间的病毒复制(Fig S4a)。有趣的是，我们偶然发现，胰岛类器官培养基中较高的葡萄糖浓度增加了病毒在上清中的复制(Fig S4b)。这些发现暗示，在血糖水平升高的情况下，从微血管血液转运到胰岛的葡萄糖可能加剧胰岛的病毒感染。FGF7处理后的胰岛类器官更容易受到SARS-CoV-2感染，这一现象可以通过FGFR抑制剂缓解。与FGF7在没有SARS-CoV-2的情况下诱导ACE2上调相反，病毒感染后FGF7处理组胰岛类器官中ACE2的基因和蛋白水平均显著降低(图4d和e)。这种降低可能归因于SARS-CoV-2病毒积累和复制加速ACE2受体的消耗。先前的一项研究也报道了SARS-CoV-2感染后ACE2的类似下调。我们进一步发现经FGF7处理的胰岛类器官中ACE2的酶活性在72 hpi时下降(图4f和g)。值得注意的是，与未感染的胰岛类器官相比，SARS-CoV-2感染随着时间的推移显著降低了胰岛类器官中ACE2的酶活性(Fig S4c和d)。IF染色表明，与G1相比，FGF7联合SARS-CoV-2显著减少了胰岛中ACE2+细胞的数量(图4h, G4组)。此外，FGFR抑制剂逆转了病毒感染期间FGF7诱导的ACE2表达降低(图4h, G5组)。在FGF7存在的情况下，暴露于SARS-CoV-2病毒后，胰岛中的ACE2比例从20%下降到9%，但在FGFR抑制剂干预后ACE2比例反弹至15%(图4i)。IF染色还显示，在FGF7处理的胰岛中，病毒N蛋白感染率大约是G1和G5胰岛的3倍(图4j)。尽管一些细胞表现出INS和病毒N蛋白的双重阳性，但大多数SARS - CoV -2感染的细胞缺乏INS表达(Fig S4e)。已有报道SARS-CoV-2可以诱导胰岛素阳性β细胞去分化为NKX6.1+祖细胞。我们的结果同样证明SARS-CoV-2感染导致β细胞胰岛素表达减少，而NKX6.1表达维持(Fig S4f)。综上所述，FGF7增强了病毒对胰岛类器官的感染，同时快速消耗了ACE2。

在SARS-CoV-2感染期间，ACE2发挥受体作用，迅速被病毒结合、消耗而导致表达水平降低，因此ACE2和活病毒少见共表达，这使得验证SARS-CoV-2是否通过ACE2直接与胰岛β细胞结合具有挑战性。刺突蛋白存在于SARS-CoV-2表面，促进病毒感染。因此刺突蛋白修饰的SARS-CoV-2假病毒已被广泛用于评估刺突蛋白与表达SARS-CoV-2相关受体(尤其是ACE2)的各种类型细胞的结合亲和力。为了评估SARS-CoV-2是否通过ACE2与胰岛结合以及FGF7是否影响结合率，我们将SARS-CoV-2假病毒与纯化的β细胞孵育。我们发现大多数允许假病毒(绿色)感染的细胞表达ACE2阳性(红色，图4k)。与对照组细胞相比，FGF7诱导的ACE2(红色)表达上调显著增强了β细胞(紫色)中的GFP(绿色)信号传导(图4k和l)。然而，FGFR抑制剂阻止了假病毒与β细胞的结合(图4k和l)。这些结果表明病毒感染β细胞主要依赖于ACE2的表达。这些结果暗示了FGF7浓度较高的COVID-19患者的胰岛β细胞损伤可能更严重。

7. 体内实验证明血清和胰腺FGF7水平在感染新冠后发生变化

为了探讨SARS-CoV-2感染对体内FGF7水平和胰岛素分泌的影响，我们进行了回顾性临床研究和动物实验。2023年1月至2023年6月在武汉市金银潭医院共招募120例COVID-19患者，采集血清样本进行FGF7 ELISA检测(图5a)。根据WHO的临床标准对COVID-19的严重程度进行分类，将患者分为4组:30例非糖尿病患者合并COVID-19轻症、30例非糖尿病患者合并COVID-19重症、30例糖尿病患者合并COVID-19轻症和30例糖尿病患者合并COVID-19重症。此外，44名健康志愿者作为未感染的对照组。在无糖尿病史的COVID-19患者中，未感染(20.30±8.85 pg/mL)、轻症(17.20±5.88 pg/mL)和重症(20.27±6.59 pg/mL)患者血清FGF7水平无显著差异(图5b)。然而，在糖尿病合并COVID-19患者中，血清FGF7浓度随新冠严重程度而升高(轻症vs重症:10.28±5.20 pg/mL vs 19.70±10.95 pg/mL, p=0.0003)。来自COVID-19患者的血清样本显示每个个体的FGF7浓度具有异质性，但FGF7水平随着COVID-19糖尿病患者的严重程度而增加，这意味着FGF7与糖尿病患者新冠症状严重程度之间存在潜在的关系。

然而，血清FGF7浓度可能不能反映FGF7在组织中的含量。因此，本研究将糖尿病小鼠(db)和野生型小鼠(wt)接种SARS-CoV-2活病毒，研究病毒感染期间FGF7水平在组织内的原位变化(图5c)。与COVID-19轻症的非糖尿病患者一样，非糖尿病小鼠血清FGF7和胰岛素水平没有显著变化(图5d和e)。小鼠胰腺组织匀浆中，原位FGF7浓度明显高于未感染对照组织(图5f)，而胰腺组织中的胰岛素浓度下降(图5g)。这与我们在hESC衍生的胰岛类器官中的观察结果一致，在SARS-CoV-2感染的情况下，FGF7上升伴随胰岛中胰岛素含量降低。在db小鼠中，暴露于SARS-CoV-2时血清FGF7水平显著下降(图5h)。同时，db小鼠血清胰岛素水平随着SARS-CoV-2感染而升高(图5i)。已有临床报告也表明，患COVID-19的糖尿病患者经常表现出胰岛素抵抗，并伴有血液中胰岛素浓度升高。

综上所述，通过hESCs衍生的胰岛类器官，作者展示了FGF7与FGFR2和FGFR1相互作用，主要上调ACE2在β细胞中表达。这种上调在新冠感染下提高了β细胞对SARS-CoV-2的易感性，进而破坏胰岛素的释放。通过抑制FGFR，可以抵消FGF7诱导的ACE2上调，进而减少病毒在胰岛中的感染和复制。此外，回顾性的临床数据显示，与新冠症状轻微的糖尿病患者相比，糖尿病合并COVID-19重症患者的血清FGF7水平升高。最后，动物实验表明，SARS-CoV-2感染增加了糖尿病和正常小鼠胰腺中FGF7的水平，导致原位胰岛素浓度降低。

这项研究提供了一种通过控制FGF7/FGFR通路来调节ACE2表达的潜在机制，进而保护胰岛免受SARS-CoV-2感染的新策略。该研究有助于在COVID-19背景下预防糖尿病的发生发展、为疫苗开发和治疗方法提供重要的科学依据。

通讯作者　刘会生

广州国家实验室研究员、广州医科大学双聘教授。主要从事干细胞分化类器官机制和临床转化研究，已发表SCI论文40余篇，包括ACS Nano、Cell Stem Cell、Nature Neuroscience、Nature Biotechnology等多篇有影响力文章。

通讯作者　徐涛

广州国家实验室副主任、广州医科大学生物医学工程学院院长、中国科学院院士。主要从事超分辨成像技术和超灵敏检测研究，在Cell、Cell Metabolism、Nature Cell Biology、Nature Methods等杂志上发表多篇有影响的研究论文。

通讯作者　赵金存

广州国家实验室研究员、广州医科大学呼吸疾病全国重点实验室主任。长期从事人类新发突发呼吸系统传染病致病机理及防治方法研究，研究结果发表于Cell、Immunity、Sci Immunol、Lancet Infect Dis、J Clin Invest、J Exp Med、PNAS等杂志。

第一作者　孟皓

广州国家实验室副研究员。主要从事水凝胶、微球、纳米粒子的合成及其在干细胞分化类器官领域的应用和转化。一作/共一发表SCI论文及著作章节共9篇，影响因子共计86.6，引用650余次（google scholar：Hao Meng）

第一作者　廖志赢

广州国家实验室/广州医科大学联合培养在读博士生。主要从事干细胞分化类器官机制学及其作为体外模型进行病毒侵染机制的研究。参与发表SCI收录论文6篇。

第一作者　季彦廷

广州国家实验室研究实习员。主要从事生物材料研发以及胚胎干细胞发育类器官机制学研究。参与发表SCI文章9篇，包括International Journal of Biological Macromolecules、Acta Biomaterialia等。

第一作者　王东

广州医科大学附属第一医院/呼吸疾病全国重点实验室博士后。主要从事呼吸系统病毒感染与宿主免疫调控的机理及干预策略研究。以一作/共一发表影响因子大于10的研究性文章4篇。

长按识别二维码关注我们！

点击下方“阅读原文”可查看原文并免费下载PDF