新型冠状病毒的爆发引起了人们对冠状病毒的重视，并加速了在冠状病毒感染和宿主相应免疫机制领域的探索。在已知的可以感染人的7种冠状病毒中，SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2可以引起严重呼吸系统综合症，重症者可最终导致死亡。在病毒和宿主的互作和拮抗中，蛋白质翻译后修饰调控发挥重要作用。其中泛素化修饰作为调控蛋白质降解和功能的重要机制，在病毒和宿主的拮抗中重要性越来越受到关注。
近日，中南大学生命科学学院夏赞贤团队在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=40.8）发表题为“A Cullin 5-based complex serves as an essential modulator of ORF9b stability in SARS-CoV-2 replication”的研究论文。该研究从病毒蛋白泛素化修饰的角度出发，筛选宿主靶向降解SARS-CoV-2附属蛋白的关键E3连接酶，发现了宿主的CUL5-TOM70-HSP90α蛋白质复合体是调控SARS-CoV-2附属蛋白ORF9b降解的关键因子，在病毒复制中发挥重要调节作用；并进一步证明了HSP90抑制剂具有开发为新型抗新冠病毒药物的潜力。
冠状病毒的基因组编码结构蛋白、非结构蛋白和附属蛋白。结构蛋白承担病毒蛋白衣壳构成，介导病毒侵入宿主细胞等功能；非结构蛋白包含多种蛋白酶，参与病毒的组装和复制；而附属蛋白则更多地参与对宿主固有免疫、细胞凋亡、自噬等通路的影响，与病毒的致病性有关。本研究针对SARS-CoV-2的附属蛋白ORF9b，发现宿主可通过泛素-蛋白酶体对其进行降解。随后，研究人员通过亲和纯化联合质谱分析，结果显示CUL5是ORF9b潜在的E3连接酶组分。经过验证，CUL5与ORF9b相互作用并能够介导ORF9b的泛素化和降解(如图1所示)，同时通过qPCR证明CUL5可通过调控ORF9b的水平影响宿主细胞的免疫应答，并进一步在新冠活病毒水平验证了CUL5促进了新冠病毒ORF9b的降解并抑制病毒的复制。
图1. CUL5调控SARS-CoV-2 ORF9b蛋白通过泛素-蛋白酶体途径降解。
现有研究显示，CUL5的N端结构域需先与ElonginB-ElonginC结合，再与以SOCS为主的底物结合受体相互作用后，才能识别底物蛋白并诱导其发生泛素化修饰和降解。然而，研究人员发现CUL5并不通过ElonginB-ElonginC介导的识别机制降解ORF9b。暗示非经典途径在CUL5介导的ORF9b蛋白泛素化降解中发挥重要作用。为了深入探究CUL5调控ORF9b降解的具体机制，研究人员对ORF9b的宿主相互作用蛋白质进行分析，结果显示ORF9b与HSP90α存在相互作用。HSP90α是HSP90的亚型，有报道发现HSP90在CUL5介导的蛋白降解中发挥作用，但扮演稳定蛋白质的角色。研究人员对此进行了验证，结果显示HSP90α确实可拮抗CUL5介导的ORF9b降解，而HSP90抑制剂GA/17-AAG则能够促进ORF9b的降解，这也提示HSP90α是潜在的抗新冠病毒药物靶点（如图2所示）。
图2. HSP90保护ORF9b蛋白免受宿主的清除。
之前的研究发现，ORF9b蛋白可以与宿主线粒体外膜转运酶70（TOM70）的C端结构域发生相互作用，并影响TOM70的N端与HSP90结合。研究人员惊奇地发现，过表达TOM70可促进ORF9b降解，而敲除TOM70之后，ORF9b不再降解。这提示TOM70才是介导ORF9b的底物结合受体。随后的研究也验证了CUL5、TOM70、HSP90α三者两两相互结合形成一个复合物，并调控ORF9b的降解（如图3所示）。后续研究人员还利用C57BL/6-hACE2小鼠模型验证了HSP90抑制剂GA/17-AAG可减弱SARS-CoV-2在小鼠中的毒力（如图4所示）。
图3. TOM70作为底物结合受体介导ORF9b降解。
图4. HSP90α抑制剂可减弱在感染SARS-CoV-2小鼠模型中病毒的毒力。
这个工作揭示了TOM70作为底物受体的关键作用，它将ORF9b与HSP90和CUL5连接起来，形成一个复合物。在这个复合物中，CUL5触发ORF9b的泛素化和降解，而HSP90则起到稳定ORF9b的作用（如图5所示）。这一研究拓宽了我们对宿主CUL5的底物降解机制的认识，同时提供了一个很好的药物作用靶点—HSP90，利用现有的HSP90抑制剂或研发特异地靶向HSP90的小分子化合物，可开发新型抗新冠病毒药物。
图5. CUL5-HSP90-TOM70复合物调控ORF9b的稳定性。
该项研究得到国家重点研发计划(2021YFC2300103)、国家自然科学基金(U21A20384和82072293)和中国博士后基金(2023M731520)的资助。该项研究也得到了广州国家实验室赵金存和蒋太交教授、清华大学程功教授、深圳市第三人民医院张政教授、中南大学代书炎教授等的大力支持。中南大学生命科学学院周宇筝博士（现为深圳市第三人民医院张政团队博士后）和博士研究生陈宗鹏为并列第一作者，中南大学生命科学学院夏赞贤教授是该论文的独立通讯作者。
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