2024年第 4 期封面
Chi, H., Zhao, SQ., Chen, RY. et al. Rapid development of double-hit mRNA antibody cocktail against orthopoxviruses. Sig Transduct Target Ther 9, 69 (2024). https://doi.org/10.1038/s41392-024-01766-8
军事科学院军事医学研究院秦成峰/邓永强团队于2024年3月27日在Signal Transduction and Targeted Therapy 发表封面文章“Rapid development of double-hit mRNA antibody cocktail against orthopoxviruses”。研究团队利用建立的纳米脂球颗粒（LNP）-mRNA技术平台，成功开发了可对正痘病毒感染提供完全保护的mRNA抗体鸡尾酒。
研究背景与意义
正痘病毒属是痘病毒科中成员最多、宿主范围最广、危害最严重的一个属，其成员包括天花病毒（VARV）、牛痘病毒（CPXV）、痘苗病毒（VACV）以及猴痘病毒（MPXV）等。特别是2022年5月以来，过去主要流行于中非和西非的猴痘疫情在全球快速蔓延，更是一度成为“国际关注的突发公共卫生事件”。截止目前，全球共有116个国家向世界卫生组织报告了超过9万例猴痘病例，死亡178例。在全球猴痘疫情的背景下，不能排除MPXV进一步发生适应性突变，导致更大规模疫情暴发的可能性。因此，快速研发针对正痘病毒的特异性治疗药物具有重要的现实意义。
中和抗体药物作为应对病毒性传染病的有效手段，曾在埃博拉、新冠等多次疫情防控过程中发挥重要作用。正痘病毒是一种双链DNA病毒，细胞内成熟病毒（IMV）和细胞外包膜病毒（EEV）是其主要的感染形式，前者是在感染的早期阶段通过经典的胞吐途径释放，而后者则是在感染晚期通过细胞裂解释放。正痘病毒间基因组高度同源，结构蛋白保守，具有相似的抗原。以痘苗病毒为例，其IMV结构蛋白L1、D8、H3和A27，EEV结构蛋白A33和B5等多个痘病毒的结构蛋白均是保护性抗原，含有重要的中和表位，可分别诱导机体产生针对IMV或EEV的中和抗体。截止目前，已有多个针对EEV和IMV表面蛋白的保护性单克隆抗体被相继报道，并经动物模型验证能够有效预防或治疗正痘病毒感染。但是，经典蛋白抗体药物的开发依赖于细胞或细菌培养，生产周期较长且制造成本高，在一定程度上影响了抗体药的实际临床可及性。mRNA技术作为一种通用性平台技术，理论上可以实现任何具有预防和治疗用途的蛋白类药物开发。mRNA抗体则是将编码特定抗体的mRNA分子通过递送系统导入体内，以机体细胞作为生物反应器来表达相应的抗体，进而发挥其生物学功能。作为一种新型的生物制剂，mRNA抗体具有制备工艺简单、易于放大产能、研发周期短、响应速度快等特点，非常适合于快速应对新突发传染病疫情。前期研究中，团队利用LNP-mRNA技术平台，成功开发了全球首个“长效型”新冠病毒mRNA抗体（Cell Research, 2022）。抗体鸡尾酒疗法（antibody cocktail）通过将不同的比例和组合把不同的抗体混合为一个药物，能够弥补单一抗体作用的不足，通常具有抵抗病毒突变和多机制协同发挥作用的优势。本研究中，研究团队分别开发了针对正痘病毒IMV或EEV的mRNA抗体，并提出了mRNA抗体鸡尾酒的概念，为快速应对下一次X疾病大流行提供了关键技术平台。
研究结果
1. 编码正痘病毒抗体mRNA的制备与鉴定
研究团队选择了4种能够交叉中和VACV、CPXV、MPXV和VARV等正痘的病毒的全人源单克隆抗体（mAb22、mAb283、mAb26和mAb301），其中mAb22、mAb283为EEV抗体（分别靶向VACV-A33、VACV-B5），mAb26和mAb301为IMV抗体（分别靶向MPXV-M1和VACV-A27）。基于上述候选抗体的编码序列，优化设计并制备了相应的抗体轻链/重链mRNA分子，包含5’非编码区（5’UTR）、信号肽、候选抗体重/轻链编码区、3’非编码区（3’UTR）和poly(A)尾（图1a）。生化试验表明，mRNA-mAb22、mRNA-mAb283、mRNA-mAb26和mRNA-mAb301分别能够在细胞水平高效表达具有生物活性的mAb22、mAb283、mAb26和mAb301抗体，转染细胞上清中的人IgG抗体水平约为665~2206 ng/mL（图1b-d）。
图1 编码正痘病毒单克隆抗体的mRNA的设计与体外表达活性鉴定
2.正痘病毒mRNA抗体的构建与表征
利用已建立的LNP-mRNA技术平台，研究团队进一步构建了4种候选正痘病毒mRNA抗体（mRNA-mab22-LNP、mRNA-mab283-LNP、mRNA-mab26-LNP和mRNA-mab301-LNP）。经检测，所制备的mRNA抗体粒径均匀（平均粒径73.12~75.39 nm），多分散系数（PDI）低于0.1。然后，将1 mg/kg正痘病毒mRNA抗体通过静脉途径注射BALB/c小鼠，采集注射后24h小鼠血清进行抗体水平和中和活性检测（图2a）。实验结果表明，静脉单次给药所制备的mRNA抗体，可在体内产生功能性抗体，血清人IgG抗体浓度约为269~2598 ng/mL，分别对EEV或IMV具有中和活性（图2b-d）。基于上述研究结果，研究团队选择了体内抗体表达效率最高的3种候选mRNA抗体（mRNA-mab22-LNP、mRNA-mab283-LNP、mRNA-mab26-LNP）用于后续体内攻毒保护效果评价。
图2 正痘病毒mRNA抗体的体内生物学活性评价
3.正痘病毒mRNA抗体的攻毒保护效果评价
利用VACV（WR株）小鼠感染模型，研究团队评估了预防静脉给药3种候选mRNA抗体的保护作用。在攻毒前一天，分别将1 mg/kg mRNA-mab22-LNP、mRNA-mab283-LNP、mRNA-mab26-LNP或空载LNP通过静脉途径注射BALB/c小鼠，于给药后24 h通过滴鼻途径感染VACV，攻毒后7天内连续监测小鼠体重变化及生存状态（图3a）。结果表明，对照组全部小鼠体重在感染后1天即开始下降，在第7天下降至初始体重的70%左右，生存率为0%。而预防性给药3种mRNA抗体均能够有效保护小鼠抵抗致死性痘苗病毒感染引起的体重下降和死亡（图3b）。同时，在攻毒后的第7天解剖小鼠，收集肺、鼻甲和肝组织进行病毒载量检测，并对肺组织切片进行H&E染色和免疫组化分析。结果表明，与对照组相比，3种候选mRNA抗体均能够有效清除肺、鼻甲等组织脏器的病毒载量，并且能够在一定程度上保护小鼠免受VACV感染引起的肺组织损伤（图3c-e）。
图3 正痘病毒mRNA抗体的攻毒保护效果评价
4. 正痘病毒mRNA抗体鸡尾酒的构建与评价
鉴于针对正痘病毒感染的高效保护需要EEV和IMV保护性抗体的同时参与，为此，研究团队将靶向EEV和IMV的候选mRNA抗体进行组合配伍，制备了2种mRNA抗体鸡尾酒Mix2a（mRNA-mab22-LNP+mRNA-mab26-LNP）和Mix2b（mRNA-mab283-LNP+mRNA-mab26-LNP），并对其体内药效学进行了系统比较（图4a）。结果显示，Mix2a和Mix2b给药组小鼠血清抗VACV IgG抗体浓度峰值均出现在静脉注射后第1天，且Mix2a给药组直至第7天仍有较高水平抗VACV IgG抗体（图4b）。此外，单次静脉注射Mix2a和Mix2b后能够在体内产生同时针对VACV EEV和IMV的功能性中和抗体，但Mix2a无论是在抗体水平和持续性上均优于Mix2b（图4c）。在小鼠感染模型中，Mix2a和Mix2b均能够100%保护小鼠抵御致死性VACV攻击、有效清除肺等组织脏器中的病毒载量，并且保护小鼠免受VACV感染引起的肺组织病理损伤。但与Mix2b相比，Mix2a给药组小鼠的体重增长更快，且肺部病毒载量更低，进一步表明Mix2a为更优的“双打击”mRNA抗体鸡尾酒疗法（图4c-f）。
图4 正痘病毒mRNA抗体的攻毒保护效果评价
近年来，随着mRNA技术的飞速发展，mRNA抗体也开始快速崛起，正在为抗体疗法注入新的生命力。本研究首次报道了经动物感染模型验证具有体内攻毒保护作用的正痘病毒的mRNA抗体疗法，成功筛选筛选获得了可同时阻断EEV和IMV形式正痘病毒感染的“双打击”mRNA抗体鸡尾酒，不仅为猴痘病毒及未来可能造成感染的其它正痘病毒防控提供了强效药物候选，同时也能够为其他传染病mRNA抗体药物的研发提供参考。
通讯作者简介：秦成峰 研究员
秦成峰,军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病毒室主任，研究员，博士生导师。国家杰出青年基金获得者。主要从事病毒学、疫苗学研究，研究方向包括RNA病毒的致病与传播机制、新型疫苗设计与改进等。先后以通讯作者（含共同）在Cell、Nature、Science等国际权威期刊发表论文200余篇，累计被引超过26,000次，连续多年入选科睿唯安“全球高被引科学家”、爱思唯尔“中国高被引科学家”。先后应邀在Nature Review Microbiology、Annual Review Virology等发表特邀综述。领衔获得北京市自然科学一等奖1项，军队科技进步一等奖1项，授权发明专利35件，多个转化产品获批医疗器械注册证和临床批件。曾获吴阶平-保罗杨森医学药学奖、中国青年科技奖、求是杰出青年奖、谈家桢生命科学创新奖、转化医学创新奖、药明康德生命化学奖（杰出成就奖）、树兰医学青年奖、中源协和生命医学创新突破奖、牛顿高级学者等。兼任中国医学科学院院外创新单元主任、中国微生物学会病毒学专委会副主任委员、中国疫苗行业协会疫苗基础研究专委会副主任委员，《Cell Research》、《Science Bulletin》、《NPJ Vaccines》等多份国内外期刊编委。
共同通讯作者简介：邓永强 研究员
邓永强，军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所研究员，博士生导师。主要从事新突发病毒感染和致病机制研究，先后承担国家和军队课题10余项。以第一/通讯作者（含并列）在Cell、Nature和Science等国际知名杂志发表SCI论文40余篇。先后授权发明专利共6项，参编专著3部。先后获军队科技进步奖一等奖和二等奖、北京市自然科学一等奖和广州市科学技术进步一等奖各1项。
第一作者简介：迟航 副研究员
迟航，军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所副研究员。主要从事病毒抗体和疫苗的理性设计与开发。以第一/通讯作者（含共同）作者在Nature、Signal Transduction and Targeted Therapy、Advanced Materials、Small Methods等发表SCI论文16篇。申请国家发明专利9项，目前已有1项获得授权；主持国家自然科学基金面上项目、青年基金项目等课题6项；入选中国科协-军委科技委“青年人才托举工程”和吉林省“青年科技人才托举工程”。
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