Nat Cancer 2024 | 胶质瘤新辅助免疫治疗

学术 2024-11-10 00:07 四川

本次分享的文献于2023年6月发表在Nature Cancer上，题目为“Siglec-9 acts as an immune-checkpoint molecule on macrophages in glioblastoma, restricting T-cell priming and immunotherapy response”是基于胶质瘤新辅助免疫治疗患者肿瘤组织的单细胞测序数据展开的，筛选出SIGLEC9作为巨噬细胞上的免疫检查点，从而限制了T细胞发挥功能，导致了对免疫治疗反应的抗性。

Introduction

1. ICB在GBM中效果差原因可能有三点：髓系导致的免疫抑制微环境，放化疗所致低淋巴细胞血症,T细胞被限制在骨髓内。新辅助免疫治疗在GBM中已显示出一定的疗效，新辅助后的GBM中有一群高表达IFNG特征的TAMs增加了T细胞的招募，因此靶向这些TAMs可能有助于增效免疫治疗

2. GBM中TAM主要分为两类，一是小胶源性的M1，在原发GBM中更多，二是骨髓单核源性的M2，在复发的缺氧微环境中更多，而M2分泌的缺氧和促血管生成分子促进血管生成从而促进胶胶质瘤的生长，因此刻画TAM的异质性非常重要

因此这项研究对24名患者进行了单细胞转录组测序，其中包含7例新发GBM，5例复发GBM，12例新辅助GBM（pembrolizumab抗PD1联合anlotinib抗VEGFR），同时对其中18名患者的34块肿瘤组织进行了空间转录组测序，鉴定出一群高表达SIGLEC9的TAM，让我们来看看这群TAM到底是何方神圣

Results

1 新辅助免疫治疗重编程了GBM免疫微环境

scRNAseq数据表征：巨噬细胞比例大，在疾病不同阶段变化较大（progressively underrepresented across disease stages），表明其在GBM中的重要功能

ST数据表征：样本间异质性大，因此用非负矩阵分解cNMF鉴定共表达模块，与瘤周相比肿瘤核心缺氧、促炎、血管生成等信号显著更强

2 新辅助免疫治疗后的T细胞变化

T细胞亚群细分：non-responder富集Treg，上调activation genes (TNFRSF9, TNFRSF4, CCL2) 和immunosuppressive genes（IL1R1, IL32），responder富集Th1，上调co-stimulatory genes （CD40LG, STMN1, CCR10, KLRB1, BHLHE40）

对CD8+T细胞进行进一步功能细分：

responder富集Texp（Tex progenitor），拟时序证实了其走向耗竭的发育轨迹，这群细胞可能与ICB响应有关

non-responder富集C9，高表达KLRB1, XCL1, XCL2，这些基因吸引DC进入TME，这和既往研究的XCL1/2促进抗肿瘤效益相悖，所以没有进一步研究

3 GBM中多样化的SIGLEC9+TAM

巨噬细胞亚群细分：关注小胶，TAMs，单核三类细胞，各自有组织分布偏好

ROGUE指数：不同分组间细胞占比的稳定性，ROGUE指数越低表明该细胞亚群不同分组间变化越大（越重要），SIGLEC9+SEPP1+TAMs（以下简称SEPP1+）和SIGLEC9+MACRO+TAMs（以下简称MACRO+）变化均较大，C7 prolif TAMs的ROGUE指数最低，可能包含不同亚群的循环细胞，可以转化为任何其他亚型

单细胞熵（Entropy）：图f，分别虚拟删失（in silico depletion）SIGLEC9, MACRO, SEPP1，发现扰动SIGLEC9后单细胞熵显著增加（更加不稳定），因此是SIGLEC9而非其他两个基因维持了这两类巨噬细胞亚型

单细胞水平差异分析的热图可视化：根据单个细胞SEPP1/MACRO表达未检出（neg）与检出（+），发现SEPP1+的抗炎和血管生成相关基因上调，MACRO+的抗炎和促炎相关基因上调，这说明这两类TAMs的高度可塑性

RNA速率分析（RNA velocity）：两类TAM均来自单核细胞，且MACRO+可能是单核细胞分化到SEPP1+的桥梁

基于scRNA和ST的空间共定位（SPOT-light）：两种亚型确实与单核细胞共定位

4 新辅助免疫治疗后SIGLEC9+TAM显著聚集且与较差的预后相关

最近的研究表明SIGLEC9会转导免疫抑制信号，阻断髓系细胞和淋巴细胞表面的SIGLEC9会增强抗肿瘤免疫。基于单细胞转录组数据发现SIGLEC9主要表达在巨噬细胞和淋巴细胞中，组织偏好分析发现SIGLEC9+细胞主要分布在non-responder中。

差异分析表明两种SIGLEC9+TAMs在responder中高表达炎症因子（APOE, IL1B, STAT1）、T细胞趋化因子（CCL3, CCL4）和IFNG相关的ISG15，在non-responder中高表达C1QA, C1QB, CD14 和 SPP1，两种亚型无明显差异。

ST分析发现循环单核先到达瘤周分化成MACRO+，再浸润到肿瘤核心分化为SEPP1+，这补充了之前拟时序分析结果

在另外两个关注髓系细胞的单细胞数据集上进一步表征本研究提出的亚型，发现SIGLEC9+与C6相关性较高且均表达免疫抑制分子GPNMB, CSTB 和 MRC1，与缺氧亚型相关性最强，这些都表明这些亚型具有免疫抑制功能。

基于TCGA的预后分析发现SIGLEC9表达以及CIGLEC9_TAM的比例与较差的预后相关，基于临床样本组织芯片的蛋白表达分析得到了同样的结论。

5 在体内敲除siglece增强了抗肿瘤活性

在体内CRISPR敲除siglece后，脾脏和淋巴结的巨噬细胞、中性粒细胞以及单核细胞的siglece显著减少，TME中结果相同，这与先前单细胞分析一致。siglece敲除鼠的肿瘤体积显著减小，生存时间显著延长。因为并未特异敲除巨噬细胞中的siglece，这里使用CSF1R单抗删失巨噬细胞，以及向TME中引入骨髓源性巨噬细胞（BMDM）和骨髓源性树突状细胞（BMDC），以此证明发挥主要作用的确实是巨噬细胞。

6 在体内敲除siglece激活了T细胞和巨噬细胞

这部分作者再次使用单细胞转录组测序，在敲除鼠的肿瘤微环境中得到了同样的结果，使用流式证实了细胞比例的差异，同时使用qPCR证实了T细胞以及巨噬细胞激活marker的上调，基于单细胞转录组与bulk转录组的富集分析进一步给出了证据。

接下来作者共培养BMDM与胶质瘤细胞，一方面说明了胶质瘤能够上调巨噬细胞上的siglece，另一方面对胶质瘤与巨噬细胞的相互作用进行了进一步探讨。据报道，Siglec-9 可与 ST3GAL4 产生的 α2,3-连接唾液酸结合，流式表明胶质瘤细胞条件培养基确实存在较多的唾液酸，用唾液酸抑制剂干预共培养物后胶质瘤对巨噬细胞上的siglece上调作用下降，这表明巨噬细胞上的siglece可以识别胶质瘤细胞产生的唾液酸。

敲除siglece另一方面也导致了肿瘤浸润T细胞以及脾脏T细胞中激活marker（CD25, IFNG, CD107）以及PD1的上调，PD1的上调作者解释为防止T细胞过度激活，这些结果表明siglece可能是巨噬细胞上的免疫检查点。

7 在体外敲除siglece携手T细胞共同抑制了GBM生长

使用CD4和CD8+T细胞的抗体敲低相应细胞后，敲除siglece带来的肿瘤抑制被解除，这说明靶向siglece可以减轻siglece+TAM导致的免疫抑制，这是通过CD4和CD8+T细胞介导的，接下来作者进而研究了siglece+TAM与T细胞的相互作用（先前在体内敲除siglece激活了T细胞和巨噬细胞部分的结果已证明敲除siglece可增强T细胞的活性）。

在体外共培养敲低vs WT的BMDMs与脾脏来源的T细胞，Transwell实验说明敲低siglece后T细胞的迁移显著增加。

8 SIGLEC9+TAM在GBM中直接与T细胞相互作用

随后基于多重免疫荧光以及ST分析对siglece+TAM和T细胞的共定位分析在空间维度证明了responder中两者相互作用的可能性更大，进一步基于单细胞转录组以及流式的结果表明两者的相互做用可能系CD44-CD44LG介导的。

9 在体内敲除siglece增强了抗PD1/PDL1的疗效

Summary

这项研究从新辅助免疫治疗患者的单细胞测序和空间转录组测序结果展开，在responder和non-responder的差异对比框架下鉴定出siglece+TAM，siglece即作为关键因子进行进一步研究。在小鼠体内敲除siglece后，再行单细胞测序评估其带来的扰动，与前分析基本相同。随后作者在动物模型中敲除siglece和WT的差异对比框架下表征了其对肿瘤的促生长作用以及免疫抑制作用。因敲除siglece后T细胞也显著被激活，作者转而通过多重免疫荧光以及ST分析进一步说明siglece+TAM与T细胞的直接作用，细胞通讯提示两者的相互做用可能系CD44-CD44LG介导的。最终，为了进一步将分析所得与临床紧密结合，这项研究还是落实在了治疗上，提出了基于siglece单抗的能够增效胶质瘤免疫治疗的可能性。

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=Mzg2MTExNTkwNA==&mid=2247558072&idx=1&sn=75d2c4bba40d5d83b926e0701dbb8f4e

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