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干细胞技术与免疫细胞疗法的完美结合
主编 | 摩西作者 | 戴维
2017年，首个CAR-T疗法（Kymriah）获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的批准用于治疗复发性或难治性的急性淋巴细胞白血病，随后几种CAR-T疗法相继上市，用于不同类型的血液肿瘤。自此，CAR-T疗法在血癌领域已有将近10年的发展和应用，并取得了显著进展。
CAR-T疗法的基本策略
但CAR-T疗法在对抗实体瘤时，临床效果仍然十分有限。造成这种差异的原因有很多，例如缺乏可以靶向的肿瘤特异性抗原、肿瘤物理屏障的存在，以及肿瘤微环境（TME）的复杂性。为了克服这些挑战，科学家们正在开发并测试多种对抗策略，包括基因工程和联合疗法。此外，像NK细胞、γδT细胞和NKT细胞等具有天然抗肿瘤能力的免疫细胞，也是CAR治疗策略的大热点。
NKT细胞是一类异质的T细胞，与T细胞和NK细胞拥有部分相同的特征
NKT细胞是一类独特的T细胞亚型，它们在血液中的数量非常少，仅占人体外周血单个核细胞的不到0.1%。它们不仅能像NK细胞那样快速杀伤细胞和分泌细胞因子，还能通过CD1d识别特殊的抗原，而不是像普通T细胞那样通过MHC识别肽类。NKT细胞在调控免疫反应、防止过度免疫激活方面起着关键作用，同时也能够对肿瘤发起免疫攻击。
在某些癌症中，NKT细胞的数量增加与更好的治疗效果有关。虽然大多数实体瘤没有表达CD1d，但NKT细胞仍然能够响应某些化学信号迁移至肿瘤，并在肿瘤微环境中清除促肿瘤的M2型巨噬细胞。
NKT细胞根据CD1d这个靶点来识别肿瘤细胞
基于这些独特的特性，研究人员开始探索将NKT细胞作为CAR治疗的平台。早期研究表明，经过基因工程改造的NKT细胞能够通过CAR靶向杀伤肿瘤细胞，并保留其自然功能去攻击CD1d阳性的细胞。
在北卡大学的最新研究中，使用表达CAR的NKT细胞不仅能直接攻击肿瘤，还能增强身体自身的T细胞反应。与传统T细胞相比，NKT细胞在处理复杂的肿瘤微环境时展现了更好的表现。例如，在某些研究中，NKT细胞还能抑制肿瘤微环境中的抑制性细胞，这将进一步增强它们的抗肿瘤效果。
一、长江后浪推前浪，CAR-NKT 细胞更要强
为了比较CAR.CD19 NKT细胞和CAR.CD19 T细胞在体内对抗肿瘤的效果，研究团队也是煞费苦心。首先，他们使用了一种特殊的小鼠模型（B16-OVA-hCD19黑色素瘤模型）。在实验开始前，研究人员给小鼠注射了环磷酰胺，这样可以轻微降低它们的淋巴细胞数量。在这个模型中，研究发现CAR-T细胞对肿瘤生长的抑制效果相对较小。
此外，研究人员还从接受CAR-T细胞治疗的小鼠中收集了肿瘤组织，发现其中浸润了CD11b+F4/80+巨噬细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs），包括两种不同类型的MDSCs（PMN-MDSCs和M-MDSCs）。这两种细胞在肿瘤微环境中起着重要的作用，特别是MDSCs，它们通常会抑制免疫反应，从而帮助肿瘤生长。有趣的是，许多在肿瘤边缘的F4/80+巨噬细胞也表达了一种标志物（CD206），这表明它们可能已经改变了其功能，表现出M2型极化的特征。M2型巨噬细胞通常与肿瘤的生长和修复过程相关，它们能够促进肿瘤的进展，而不是直接攻击肿瘤细胞。
CAR-NKT细胞表现出优于CAR-T细胞的抗肿瘤活性
在该模型中，研究团队还比较了CAR-T细胞和CAR-NKT细胞的抗肿瘤能力，结果显示CAR-NKT细胞对肿瘤的控制效果更佳，并且能够延长小鼠的生存时间，而且没有明显的毒性。此外，在另一个增加肿瘤负担的实验中，CAR-NKT细胞同样表现出了良好的抗肿瘤效果。
为了进一步确认CAR-NKT细胞在不同类型肿瘤模型中的优势，研究人员建立了两种额外的肿瘤模型：一种是通过静脉注射B16-OVA-hCD19细胞创建的转移模型，另一种是通过腹腔植入表达小鼠自体抗原B7-H3的ID8肿瘤细胞创建的卵巢癌模型。在这两种模型中，研究人员都观察到了巨噬细胞的浸润，而CAR-NKT细胞在抗肿瘤效果上优于CAR-T细胞。
总的来说，这些数据都表明CAR-NKT细胞在体内对抗肿瘤的效果要优于CAR-T细胞。
二、破巢之下无完卵，CAR-NKT 细胞铲除“保护伞”
在研究 CAR-NKT 细胞对抗肿瘤的机制时，科研人员首先关注了 CAR（嵌合抗原受体）的表现。实验涉及到两种小鼠模型：一种是 CD45.2 型小鼠，另一种是 CD45.1.2 型小鼠。科研人员分别从这两种小鼠中生成 CAR-NKT 细胞，并将它们注入到携带 B16-OVA-hCD19 肿瘤的 CD45.1 型小鼠体内。通过观察肿瘤和引流淋巴结中 CAR-NKT 细胞和 CAR-T 细胞的浸润情况及存活率，科研人员发现 CAR-NKT 细胞在肿瘤内部的积累相对较少，但在肿瘤引流淋巴结中的积累却更为显著！
进一步研究发现，NKT 细胞会表达高水平的 TRAIL（肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体），它可以诱导肿瘤细胞的凋亡。科研人员分析了由 CAR-NKT 细胞或 CAR-T 细胞处理的小鼠肿瘤中细胞死亡相关蛋白的表达。结果显示，无论采用哪种治疗方式，肿瘤细胞的死亡与裂解的 caspase-3 水平密切相关，而 CAR-NKT 细胞治疗产生的 CC3 水平显著高于 CAR-T 细胞。
科研人员进一步假设，CAR-NKT 细胞的优越抗肿瘤活性与其调节肿瘤微环境（TME）的能力有关。在治疗第 16 天，科研人员收集了 B16-OVA-hCD19 肿瘤，分析了不同组别的免疫细胞浸润情况。通过单细胞 RNA 测序，科研人员发现所有四组都有不同的白细胞浸润情况，其中 CAR-NKT 细胞的治疗组显示出对免疫抑制性巨噬细胞（TAM2）、嗜碱性粒细胞和中性粒细胞的显著减少。这表明CAR-NKT细胞可能通过抑制特定的免疫抑制细胞，增强抗肿瘤免疫反应，从而提高治疗效果。
CAR-NKT细胞在体外调节TME并靶向巨噬细胞
此外，研究还显示，与未转导的 NKT 细胞相比，CAR-NKT 细胞的频率也出现了增加，同时单核细胞和 TAM2 细胞的耗竭现象明显。科研人员对 CAR-NKT 细胞与巨噬细胞的相互作用进行了比较，发现这两种细胞都能有效清除多种类型的巨噬细胞，并能分泌 IFN-γ，而 CAR-T 细胞则未能清除这些巨噬细胞。
通过进一步分析，科研人员发现 CAR-NKT 细胞处理的小鼠比 CAR-T 细胞处理的小鼠有更多的免疫细胞浸润，尽管 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的频率变化不大，但 CAR-NKT 细胞显著减少了肿瘤中的 TAMs。免疫荧光分析结果表明，CAR-NKT 细胞和对照 NKT 细胞减少了肿瘤中 M2 型巨噬细胞的浸润，而 M1 型巨噬细胞的数量没有变化。
CAR-NKT细胞减少TME内的TAM
最后，为了证明 CAR-NKT 细胞介导的 M2 型巨噬细胞减少是 CD1d 依赖性的，科研人员在 CD1d 敲除小鼠中建立了相应的肿瘤模型。结果显示，在这一模型中，CAR-NKT 细胞和 CAR-T 细胞表现出相似的抗肿瘤活性，且没有明显的毒性反应。综合来看，CAR-NKT 细胞的抗肿瘤能力强于 CAR-T 细胞，这种优势在于对 M2 型巨噬细胞的选择性减少，而低表达 CD1d 的 M1 型巨噬细胞则不受影响。
三、运筹帷幄决胜千里，CAR-NKT 细胞重新激活免疫军团
在这项研究中，研究团队其实还有一项突破性进展，他们发现B16-OVA-hCD19肿瘤表面有一种叫做OVA的抗原，这种抗原能引发强烈的免疫反应。因此，研究团队想知道CAR-NKT细胞是否能够通过刺激“表位扩散”并激活体内的OVA特异性T细胞，以此来增强抗肿瘤的效果。
首先，研究团队创造了一种只表达人类CD19的肿瘤细胞系B16-hCD19，并将其注入小鼠。接着，研究团队给这些小鼠注入了CAR.CD19 NKT细胞和CAR.CD19 T细胞。结果发现，CAR-NKT细胞的抗肿瘤效果明显优于CAR-T细胞，但与B16-OVA-hCD19模型中的效果相比，差距不那么明显。这到底是为什么呢？
为了进一步了解CAR-NKT细胞对OVA特异性T细胞的激活，研究团队分析了接受不同治疗的小鼠的肿瘤。结果显示，接受CAR-NKT细胞治疗的小鼠肿瘤中，OVA特异性CD8+ T细胞的数量显著多于接受CAR-T细胞治疗的小鼠。此外，CAR-NKT细胞治疗的小鼠中，NK细胞的数量也显著增加，这表明CAR-NKT细胞能够有效增强抗肿瘤免疫反应，促进OVA特异性T细胞和NK细胞的激活与增殖。CAR-NKT细胞不仅能直接攻击肿瘤细胞，还能通过激活特定的T细胞增强整体免疫反应！
CAR-NKT细胞通过增强DC激活促进T细胞反应
此外，研究团队还发现接受CAR-NKT细胞治疗的小鼠肿瘤中DC细胞的数量更多，且这些细胞的CD80和CD103表达水平要高于接受CAR-T细胞治疗的小鼠。这表明它们的抗原提呈水平也增加了，免疫系统可以更容易发现这些肿瘤细胞，增强了整体的抗肿瘤能力。
最后，在某些特定的小鼠模型中，研究团队没有发现OVA特异性CD8+ T细胞的增加，这表明CAR-NKT细胞与DC之间的相互作用还是依赖于CD1d的。
四、如虎添翼，PD1阻断疫苗助力CAR-NKT细胞所向披靡
我们都知道，在免疫系统中，T细胞是抵抗肿瘤和病毒的重要战士。然而，随着时间的推移，这些细胞有时会变得“疲惫”，不再有效地发挥作用，这种现象被称为“T细胞耗竭”。虽然CD8+ T细胞的耗竭现象已被广泛研究，但对自然杀伤T细胞（NKT细胞）和CAR-NKT细胞（通过基因工程改造的NKT细胞）的耗竭研究相对较少。
为了改变这种情况，研究团队在B16-OVA-hCD19模型小鼠身上注入了来自另一组小鼠的CAR.CD19 NKT细胞。这使得研究人员能够观察这些CAR-NKT细胞是否会随着时间的推移而变得疲惫。在观察过程中，研究人员发现这些细胞中一些重要的“疲惫”标记物（PD1和TIM3）的数量逐渐增加，显示出它们的抗肿瘤能力正在减弱。同时，这些细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）和格朗齐酶B（GrB）在最初几天内有所增加，但在后期却有所下降。
接下来，研究团队使用了高肿瘤负担的模型，结合较低剂量的CAR.CD19 NKT细胞，以模拟慢性抗原刺激对这些细胞的影响。在这一实验中，研究人员发现，单独使用CAR-NKT细胞或阻断PD1的药物都能够适度延缓肿瘤的生长。然而，当将这两种治疗结合起来时，肿瘤的生长得到了显著的控制。这表明，联合作用可能会产生更强的抗肿瘤效果！
抗 PD1 治疗和疫苗接种在高肿瘤负荷模型中增强 CAR-NKT 细胞的抗肿瘤能力
研究还显示，结合PD1阻断与CAR.CD19 NKT细胞的治疗可以增加肿瘤内NKT细胞的数量，并提高分泌IFN-γ和GrB的细胞比例，这可能使肿瘤更容易受到攻击。
最后，研究团队总结了这样一种新的策略：通过PD1阻断疫苗接种来增强CAR-NKT细胞的抗肿瘤效果。研究发现，当使用一种名为α-GalCer的物质与树突状细胞（DCs）或多阶段载体结合时，能够进一步提升NKT细胞的抗肿瘤活性。经过实验，研究人员发现这些疫苗不仅提升了CAR-NKT细胞的能力，还延缓了肿瘤的进展，显示出疫苗与免疫细胞结合使用的强大潜力，为未来的癌症治疗提供了新的思路。
五、总结与展望
作为一种新兴的免疫疗法，CAR-NKT细胞在治疗神经母细胞瘤（NBL）这种实体肿瘤时，已经显示出了良好的临床效果，并且能够显著扩增到临床规模。这项研究的关键在于开发适当的临床前模型，以评估NKT细胞与免疫系统之间复杂的相互作用，这些在传统的免疫缺陷小鼠模型中是无法充分体现的。
北卡大学的研究团队采用了多种同基因肿瘤模型，展示了自体CAR-NKT细胞相比于CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤活性。CAR-NKT细胞通过多种机制发挥这种优势：一方面，它们能够通过特异性靶向肿瘤细胞直接进行攻击；另一方面，它们还可以消除M2样巨噬细胞，并通过NKT-iTCR与肿瘤微环境中的抗原呈递细胞（如树突状细胞和肿瘤相关巨噬细胞）上表达的CD1d相互作用，从而刺激内源性T细胞的反应，并激活免疫系统。
此外，研究团队还创新性地结合了PD-1阻断和疫苗接种，使得CAR-NKT细胞的抗肿瘤活性进一步得到增强。
总之，这些发现证明了CAR-NKT细胞在实体瘤治疗中发挥的多重作用，进一步支持了它们在临床研究中的应用潜力。希望未来的研究能够揭示其更广泛的临床应用价值，为实体瘤癌症患者带来新的希望！
