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大量证据支持胆固醇在动脉粥样硬化发展中的因果作用，部分机制是通过激活NLRP3–IL-1β通路。尽管在这一领域取得了进展，但胆固醇过量引发炎症性斑块形成的具体机制仍然不完全清楚。除了循环中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度外，暴露时间（即年龄与LDL-C曲线下的面积）也是ASCVD事件发生的独立预测因子。值得注意的是，胆固醇积累的时间过程是ASCVD事件的一个强大的独立决定因素，早期积累与更高的心血管疾病风险相关。此外，循环胆固醇水平的周期性波动，即使在他汀治疗下，也与ASCVD事件的发生独立相关。因此，问题在于：(1) 早期和间歇性血清胆固醇波动如何增加ASCVD风险；(2) 如何建立模型来理解其潜在机制。近期，剑桥大学的Ziad Mallat教授团队在Nature上发表了题为Early intermittent hyperlipidaemia alters tissue macrophages to fuel atherosclerosis的研究文章。本文表明，年轻时的高胆固醇水平，可能比晚年才开始的高胆固醇水平更具破坏性。![]()
图一：早期间歇性高脂血症加速了小鼠的动脉粥样硬化进程
研究团队将低密度脂蛋白受体缺陷型（Ldlr−/−）的小鼠分为两组，一组接受早期间歇性高胆固醇西方饮食（iWD），另一组则接受晚期持续的高胆固醇饮（cWD）。这种设计巧妙地模拟了人类在不同生命阶段接触高胆固醇环境的情况。在一系列实验中，我们对缺乏低密度脂蛋白受体（Ldlr−/−）的雄性小鼠进行了6周的晚期持续西方饮食（cWD）与6周的早期间歇性西方饮食（iWD）的比较（图1a）。我们在实验期间重复测量了血浆胆固醇水平，并计算了实验持续期间的平均累积血浆胆固醇水平（图1b）。两组小鼠的整体胆固醇负荷（胆固醇×时间）相似。根据胆固醇累积暴露是动脉粥样硬化的主要决定因素这一范式，我们本应在两组小鼠中发现大小相似的动脉粥样硬化病变。然而，我们对接受iWD的小鼠斑块大小显著增加感到惊讶，相比之下，cWD组小鼠的斑块较小（图1c,d）。接受12周iWD的小鼠与接受12周晚期cWD的小鼠相比，仍然表现出显著更大的动脉粥样硬化斑块（图1e,f），且伴有很大的坏死核心，与凋亡细胞残骸的积累和吞噬功能缺陷有关）。我们还研究了适应性免疫的作用，发现尽管循环胆固醇水平相似，但在缺乏T细胞和B细胞的Ldlr−/−Rag2−/−小鼠中，iWD诱导的动脉粥样硬化加速仍然发生（图1h）。尽管特定T细胞和B细胞亚群的作用需要进一步研究，但我们的结果表明，非适应性免疫反应在这一过程中发挥了关键作用。
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图二：早期间歇性高脂血症改变了类似驻留型的动脉巨噬细胞我们进行了两组独立实验，每组包含九只小鼠，并将每组的六个独立样本池（每池三只小鼠）合并分析。结果显示，与持续西方饮食（cWD）喂养的小鼠相比，间歇性西方饮食（iWD）喂养的小鼠的主动脉巨噬细胞中有746个基因差异表达（DEGs）（图2a,b）。基因本体（GO）术语富集分析表明，自噬（宏自噬）减少可能是主要的致病过程（图2a），这与已知的自噬在限制小鼠斑块炎症、坏死和进展中的作用相符。值得注意的是，这一自噬缺陷途径包括几个与自噬相关的基因（例如Atg12和Wdfy4，这些基因在Wdfy3通路中起作用，以及Vps33a；图2b），这些基因最近被鉴定为巨噬细胞吞噬功能的主要调控因子。为了研究驻留型动脉巨噬细胞在动脉粥样硬化中的具体作用，我们重点关注了Lyve1表达的巨噬细胞，它们驻留在健康动脉的外膜中，并且是动脉粥样硬化病变中类似内膜驻留的TLF巨噬细胞的一部分，尽管内膜的TLF巨噬细胞通常不表达LYVE1蛋白。三周的iWD喂养并未影响驻留于外膜的巨噬细胞的积累，但显著降低了大量其原型基因的表达（图2b）。我们推测，基因表达的这种深刻改变可能会在长期内影响巨噬细胞的生存。因此，我们评估了不同阶段动脉粥样硬化小鼠中LYVE1+巨噬细胞的积累情况（图2c）。我们检测到，随着时间推移，主动脉中LYVE1+巨噬细胞显著逐渐减少，并且这种减少与动脉粥样硬化斑块的程度呈显著负相关（图2d,e）。我们还分析了人类健康与动脉粥样硬化的冠状动脉，发现与健康动脉相比，动脉粥样硬化动脉中的驻留型LYVE1+巨噬细胞的积累显著减少（图2f,g），支持了我们发现的临床相关性。![]()
图三：LYVE1+驻留巨噬细胞的删除会加速动脉粥样硬化的进程为了直接研究Lyve1表达的巨噬细胞在动脉粥样硬化发展中的作用，我们在载脂蛋白E缺陷（Apoe−/−）背景下生成了Lyve1cre+/WTCsf1rflox/flox小鼠（及Csf1rflox/flox对照组），选择性消除LYVE1+巨噬细胞，并评估其基因删除对动脉粥样硬化的影响。与Apoe−/−Csf1rflox/flox小鼠相比，Apoe−/−Lyve1cre+/WTCsf1rflox/flox小鼠中的LYVE1+巨噬细胞显著减少，并且这与动脉粥样硬化斑块大小显著增加相关（图3a,b）。对斑块组成的分析显示，平滑肌细胞和胶原含量相当，然而，我们发现内膜中的CD68+巨噬细胞积累增加（图3c），坏死核心面积也增加（图3d）。我们还使用了另一种高脂血症模型。将Csf1rflox/flox和Lyve1cre+/WTCsf1rflox/flox小鼠注射AAV8-D377Y-mPCSK9病毒，并分别接受6周的cWD或iWD。结果显示，在对照组Csf1rflox/flox小鼠中，iWD导致斑块大小和坏死核心面积显著增加（图3e–h），然而，这些iWD依赖的效应在LYVE1+巨噬细胞被删除的小鼠中有所减弱（图3i–l）。我们的数据表明，驻留型动脉巨噬细胞在动脉粥样硬化的进展过程中发生了改变，而这种改变进一步加剧了疾病的进展。![]()
图四：动脉驻留巨噬细胞中ASCVD通路的改变加速了动脉粥样硬化的进程为了进一步了解导致iWD依赖的动脉粥样硬化加速的机制，我们评估了这些发现与人类ASCVD机制的相关性。我们发现巨噬细胞的差异表达基因（DEGs）（图2b）在全基因组关联研究（GWAS）中富集了被证实或预测与人类ASCVD因果相关的基因（图4a）。在可分配给特定巨噬细胞亚群的DEGs中，大部分属于MACAIR/TREM2样或驻留型TLF+巨噬细胞（图4b）。例如Phactr1（图2b），其缺陷会加速小鼠动脉粥样硬化斑块坏死，并且其在人类动脉中的表达受与人类ASCVD因果相关的遗传变异控制，该基因与冠状动脉粥样硬化负担的影像学确定相关。为了识别与iWD依赖的动脉粥样硬化加速相关的新靶点并与人类ASCVD相关，我们分析了公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，结果发现22个GWAS-ASCVD相关的差异表达基因（DEGs）在症状性与无症状性颈动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞中表现出显著差异表达（图4c）。此外，我们对现有动脉巨噬细胞单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据的荟萃分析显示，NRP1在小鼠（图4d）和人类（图4e）的驻留型TLF+巨噬细胞中优先表达。NRP1高表达的巨噬细胞在与细胞迁移和肌动蛋白细胞骨架重组相关的生物通路中富集（图4f）。其他与动脉粥样硬化相关的重要生物通路，例如受体介导的内吞作用、白细胞趋化的调节、细胞凋亡过程和补体活化，也在NRP1高表达的巨噬细胞中得到了富集（图4f）。与晚期持续西方饮食（cWD）相比，早期间歇性高脂血症（iWD）加速了Ldlr−/−小鼠中动脉粥样硬化的发展，这些小鼠的骨髓为Lyz2cre+/−Nrp1+/+（图4g）。相反，在iWD下，髓系细胞中Nrp1的缺失对动脉粥样硬化的发展没有影响（图4g）。来自重建的Ldlr−/−小鼠的NRP1缺乏和NRP1充足的腹膜巨噬细胞的整体RNA测序分析显示，Nrp1缺失改变了巨噬细胞的表型，并影响了与肌动蛋白丝相关的生物通路、细胞骨架组织、细胞粘附和凋亡（图4h）。我们的结果促使我们假设，早期生命阶段（儿童期、青春期和年轻成人期）对胆固醇的暴露可能是中年动脉粥样硬化的强决定因素，而与终生累积暴露无关。因此，我们分析了年轻芬兰人研究（YFS）的数据，该研究是一个前瞻性队列研究，于1980年启动，参与者年龄在3至18岁之间。此后定期进行随访检查。我们对YFS中的两个参与者子集进行了分析，这些子集在进行颈动脉超声检查时参与了研究：在2001或2007年随访时年龄在24至45岁之间的2653名参与者，以及在2018年随访时年龄在41至56岁之间的2062名参与者。尽管有一些迹象表明，青春期和年轻成人期的non-HDL-C暴露对观察到的终身效应贡献最大，但在成年之前（即儿童期和青春期）的non-HDL-C水平的暴露始终占据了中年斑块结果终身效应的一半以上。这表明，成年之前的胆固醇暴露与中年动脉粥样硬化的发展密切相关。总结：高脂血症是动脉粥样硬化心血管疾病（ASCVD）的主要风险因素。心血管事件的风险依赖于低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的累积终生暴露量，并且与LDL-C的暴露时间过程独立，早期暴露与更高风险相关。此外，LDL-C波动与ASCVD结果也存在关联。然而，这种ASCVD风险增加的具体机制尚不清楚。在本研究中，我们发现，与晚期连续暴露于高胆固醇西方饮食（WD）相比，早期间歇性喂养小鼠会加速动脉粥样硬化，尽管其累积循环LDL-C水平相似。我们发现，早期间歇性高脂血症改变了类驻留动脉巨噬细胞的数量和稳态表型。基因表达改变的巨噬细胞基因在基因组范围关联研究中富集了与人类ASCVD相关的基因。我们展示了LYVE1+驻留巨噬细胞具有抗动脉粥样硬化作用，并识别了与微丝组织相关的生物通路，其改变会加速动脉粥样硬化。通过年轻芬兰人研究，我们显示，早期胆固醇暴露与中年时颈动脉动脉粥样硬化斑块的发生率和大小显著相关。总之，我们的结果确定了早期间歇性胆固醇暴露作为加速动脉粥样硬化的强决定因素，强调了早期控制高脂血症的重要性，并提供了潜在生物机制的见解。这些知识对于设计有效的治疗策略以应对ASCVD至关重要。参考文献：Takaoka M, Zhao X, Lim HY, et al. Early intermittent hyperlipidaemia alters tissue macrophages to fuel atherosclerosis. Nature. 2024;634(8033):457-465. doi:10.1038/s41586-024-07993-x![]()
