Cell | 多维度药物筛选发现MD2是治疗心脏纤维化的新靶点

学术   2024-11-10 20:01   浙江  

近日,来自斯坦福大学医学院Joseph C. Wu团队在Cell上发表了题为Multiscale drug screening for cardiac fibrosis identifies MD2 as a therapeutic target的研究论文。作者开发了一种新的高通量多维度药物筛选技术,找到一种药物为青蒿琥酯(ART),并且在人原代CFs3D工程化心脏组织(EHTs)以及心脏纤维化和HF小鼠模型都验证了抗纤维化作用。结合计算机模拟、分子实验验证和多组学,表明ART通过MD2抑制心脏纤维化。

摘要图
心脏纤维化作为一种损害心脏功能的疾病,目前缺乏有效的临床治疗方法,因此寻找潜力候选药物成为了研究的重要方向。

作者首先利用人类iPSCs建立了一个多维度药物筛选平台,根据药物疗效进行筛选,随后进行二次筛选以排除具有潜在心脏毒性的药物。接着研究者验证了候选药物的治疗效果,最终发现青蒿琥酯(ART)为首选的化合物,ART治疗可抑制TGF-β1刺激下ACTA2COL1A1表达,且无心脏毒性。

 

1. 多维度筛选抗纤维化药物模式图

接下来,作者评估了ART抗心肌纤维化的作用。作者在人原代成纤维细胞上利用TGF-β1诱导,发现ART可以抑制细胞增殖,迁移和胶原生成。为更好评估ART的治疗效果,研究团队采用了3D培养技术,构建了工程化心脏组织(EHTs)。用TGF-β1预先刺激EHTs 3天,然后在继续TGF-b1刺激的同时给予ART治疗3天。发现ART显著改善了EHTs收缩和舒张速度,减轻了被动组织张力,并降低了ACTA2COL1A1表达。

2.青蒿琥酯可以抑制成纤维细胞和工程化心脏组织的肌成纤维细胞活化

进一步,作者应用了TACIR两种心衰小鼠模型,证实了ART在体内具有抗纤维化和改善心功能的作用。

3.在心衰小鼠模型中,青蒿琥酯可减轻纤维化并改善心功能

为揭示TAC模型中ART治疗后CF转分化的动态,作者对动物模型的三个组进行了单核RNA测序(snRNA-seq)。通过对这成纤维细胞群中差异表达基因分析显示,TAC中多个上调基因都被ART显著抑制。并通过GOKEGG通路分析表明,这些基因主要参与纤维化发展,如TGF-β信号传导,ECM组织、胶原形成和膜-ECM相互作用。将成纤维细胞组分分为6个亚群,发现模型组上调的亚群经ART处理后被逆转。并且使用拟时间分析对成纤维细胞群进行排序,拟时间相关的动态基因与纤维化高度相关,表明拟时间轨迹与MyoFB转分化的动态相匹配。

4. 青蒿琥酯抑制tac诱导的成纤维细胞群的动态变化

接下来,作者分析了ART对成纤维细胞中信号通路的调控。结果显示,ART能以剂量依赖性的方式抑制人原代CFsTGF-β1IL-11处理后肌成纤维细胞(MyoFB)标志物和细胞外基质基因的表达。此外,ART还抑制了人类病变心肌病MyoFB中的这些纤维化基因的表达。为更全面了解转录组变化,研究对6个独立的细胞系中溶剂处理和ART处理的原代CFs进行了RNA测序分析通过GO富集分析,发现ART下调了多个信号通路,包括ECM组织、胶原形成、细胞增殖与迁移、平滑肌收缩以及结缔组织发育。这些结果表明,ART能够在外源性促纤维化刺激下,减弱人原代CFs纤维化基因表达和信号通路激活,并抑制肌成纤维细胞活化。 

5.青蒿琥酯抑制纤维化基因和通路

ART治疗疟疾是通过结合红细胞中的血红素产生ROS,但是血红素相关基因不在CFs中表达,说明抗纤维化和抗疟疾作用之间存在不同的机制。

据报道,ART可以抑制巨噬细胞中的Toll4信号转导,但是并不清楚TLR4信号在CFs中的作用以及ARTTLR4之间的关系。MD2TLR4相互作用的共受体,为了验证MD2TLR4在心脏纤维化中的作用,作者发现在MD2或者TLR4敲低的情况下,都抑制了CFs转分化,并且减轻了MyoFB激活。并应用了相关抑制剂进一步验证,说明ART通过MD2/TLR4信号通路的介导抗纤维化作用。作者还利用SPR、分子动力学模拟进一步验证ARTMD2之间的相互作用。

6. MD2是青蒿琥酯的靶点

最后,作者通过PLACO-IP验证了ART可显著抑制MD2-TLR4相互作用及下游ERK通路激活。此外,研究者在人原代CFs中进行了ATAC-seq,发现ART降低了TGF-β1处理后纤维化相关基因(如COL1A1FN1TAGLNCTGF)的染色质可及性,提示ART显著抑制了TGF-β1诱导的纤维化相关通路。

7.青蒿琥酯抑制MD2-TLR4相互作用及其下游级联反应

总结来讲,本文开发了新的高通量多维度药物筛选技术,从约5000个化合物中找到了治疗心脏纤维化的新药—青蒿琥酯。机制上,青蒿琥酯靶向MD2,抑制MD2/ TLR4信号通路,能有效抑制心脏成纤维细胞中的纤维化基因表达,抑制其增殖、迁移和收缩,减少胶原沉积,改善心衰小鼠心功能。

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