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免疫吸附在高致敏肾移植受者围手术期应用的单中心经验总结
浙江树人学院树兰国际医学院附属树兰杭州医院肾脏病科，全省人工器官与计算医学重点实验室，杭州 310022
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副主任医师
中华医学会器官移植学分会青年委员
浙江省医学会肾脏病学分会青年委员
浙江省医师协会肾脏病学分会青年委员
国家创伤医学中心器官保护专业委员会青年委员
浙江省生物医学工程学会肾病透析移植分会青年委员
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医学博士、博导、主任医师
树兰（杭州）医院院长、肾移植科主任
中华医学会器官移植分会全国常委
中国医师协会器官移植分会肾移植学组副组长
中国医师协会器官移植分会常委
中国医师协会器官移植分会活体器官移植专业委员会副主任委员
浙江省医师协会肾脏内科医师分会第三届委员会副会长
浙江省医师协会常委
浙江省医学会器官移植分会副主任委员
浙江省透析移植学会副会长
浙江省社会办医协会副会长
浙江省透析质量控制委员会委员
《Chinese Medical Journal》《中华器官移植杂志》编委
国家自然科学基金委评审专家
【摘 要】目的探讨免疫吸附在高致敏肾移植受者的应用价值。
方法回顾性分析2019年9月至2023年4月于树兰（杭州）医院接受蛋白A免疫吸附去致敏治疗后行肾移植的26例高致敏肾移植受者的相关数据及临床资料，总结免疫吸附降低高致敏肾移植受者抗人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）抗体的效果及去致敏治疗后手术的成功率及术后并发症的发生率。
结果26例高致敏肾移植受者在术前接受免疫吸附去致敏治疗（10.76±5.53）次，受者HLA⁃Ⅰ类抗体最高水平平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）从17 921±4 442降低至7 333±6 434，下降率为59%；HLA⁃Ⅱ类抗体最高水平MFI从21 135±5 245降低至10 989±7 627，下降率为48%，治疗前后差异均有统计学意义（P值均<0.001）。治疗后26例受者均行遗体捐献肾移植手术，7例受者术后早期发生急性抗体介导的排斥反应，3例受者围手术期发生肺部感染，2例受者发生骨髓抑制；随访时间为（30.8±12.6）个月，移植肾存活率为88.5%（23/26），受者存活率为100%（26/26）。
结论免疫吸附能有效降低高致敏肾移植受者的HLA抗体水平，增加肾移植手术的成功率；但其可能增加受者感染和骨髓抑制的风险，需引起进一步的重视。
【关键词】 肾移植；免疫吸附；抗人类白细胞抗原抗体；抗体介导的排斥反应；高致敏受者人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）抗体是针对HLA的免疫球蛋白，也被称作群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）；若该抗体针对移植肾供者，也被称为供者特异性抗体（donor specific antibody，DSA）。无论是术前预存还是术后新生的DSA，都会对移植肾造成严重影响，导致移植肾失功[1⁃2]。美国器官共享联合网络数据库的信息显示，约30%的肾移植等待者存在HLA抗体，被称为致敏受者；约6.5%的等待者PRA大于80%，为高致敏受者[3]。这类肾移植受者，术后发生急性抗体介导的排斥反应（antibody⁃mediated rejection，AMR）的比例为30%以上[4⁃5]，移植肾丢失率是普通受者的4.73倍。因此为高致敏受者实施肾移植是非常艰巨的挑战[6⁃8]。手术成功的关键因素是控制受者围手术期的HLA抗体水平，目前血浆置换联合小剂量静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）是控制HLA抗体水平最成熟和有效的方案[9]。随着技术发展，免疫吸附技术在降低HLA抗体水平的作用越来越重要[10⁃13]。蛋白A免疫吸附技术是利用葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A，SPA）特异性与免疫球蛋白结合的原理，降低人体循环中免疫球蛋白，从而降低HLA抗体水平，避免发生急性AMR，并降低其对移植物的损伤[13⁃14]。目前蛋白A免疫吸附技术已广泛应用于自身抗体相关风湿免疫系统疾病与神经系统疾病的治疗，并且获得不错的疗效[15⁃16]。在肾移植领域，已有相关报道证实免疫吸附能降低HLA抗体水平，实现高致敏受者的肾移植[17]。还有研究指出，术前交叉配型阳性的致敏受者，使用免疫吸附进行围手术期脱敏治疗后，可与未致敏受者预后相似[18]。因此，本文旨在通过回顾性分析树兰（杭州）医院高致敏受者围手术期使用免疫吸附技术后行肾移植的临床资料，总结免疫吸附技术在高致敏肾移植受者中的有效性及安全性。回顾性分析2019年4月至2023年4月树兰（杭州）医院高致敏肾移植受者26例。入选标准：年龄大于18岁，术前术后临床资料完善；术前行免疫吸附治疗降低抗体水平，且均在治疗后实施了肾移植。排除标准：治疗期间使用过血浆置换降抗体治疗。所有供肾均来自遗体捐献，由中国人体器官分配与共享计算机系统分配。本研究经树兰（杭州）医院伦理委员会审核通过（伦理号：KY2023078），受者及其家属知情同意。采用Luminex固相免疫技术（solid phase immunoassay，SPI）包被的纯化HLA单抗原微珠（single antigen beads，SAB）检测外周血特异性HLA抗体，并通过其平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）半定量测定HLA抗体强度。通过常规血液净化通路（深静脉插管或动静脉内瘘）建立体外循环，并予适当抗凝（常规使用低分子肝素，根据手术及出血情况可选择普通肝素、枸橼酸钠、阿加曲班或萘莫司他），首先将引出体外的血液经血浆分离器分离血浆，血流量150 ml/min左右，分离血浆通过血浆泵以30~40 ml/min的流速进入蛋白A免疫吸附柱进行吸附，吸附时间为15~20 min；吸附完毕后，使用生理盐水回输血浆；血浆回输完毕后，用洗脱液洗脱吸附的抗体，流速为70 ml/min，待洗脱液pH为2.2~2.8时洗脱结束，再用平衡液中和至洗脱液pH 7.0；然后再用生理盐水再次预冲，完成吸附柱再生；再生后，可引血浆重新进行吸附。连续循环吸附8~10次为1个疗程，根据血浆泵的泵速调整吸附时间，单个循环处理的血浆量为500~600 ml，每个疗程约4~6 h，处理总血浆量为4 000~6 000 ml。常规使用利妥昔单抗清除外周血B淋巴细胞协助降低HLA抗体。在脱敏治疗前使用，单次剂量在200~500 mg，根据受者体重及抗体水平有所调整，治疗目标为围手术期外周血CD19阳性B淋巴细胞计数小于10个/μl，如B淋巴细胞计数反跳，可考虑再次使用利妥昔单抗100~200 mg。移植手术当天开始使用兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白0.5~1 mg·kg–1·d–1，共3~5 d；或者使用巴昔利单抗20 mg，手术当天和术后第4天各1次。去致敏治疗过程中不常规使用IVIG，治疗过程中监测受者外周血免疫球蛋白水平，当外周血免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）水平低于5 g/L时，在免疫吸附结束后立即给予人免疫球蛋白50~100 mg/kg。在肾移植术后常规使用1~2周IVIG（200~400 mg·kg–1·d–1）预防HLA抗体水平反跳或针对潜在致敏位点的新抗体产生。免疫吸附治疗后，如抗体整体MFI下降明显，最高抗体MFI小于5 000，可暂停免疫吸附，等待移植配型，期间定期复查抗体；如整体抗体下降不明显，但虚拟配型无DSA或者DSA的MFI小于5 000，可考虑行肾移植手术。手术当天应用甲泼尼龙500 mg冲击治疗，术后第2、3天分别使用甲泼尼龙250 mg，再逐渐降低剂量，直到改用泼尼松口服。移植后常规采用他克莫司+麦考酚钠+糖皮质激素三联免疫抑制方案，并根据他克莫司血药谷浓度调整用量，术后他克莫司的药物浓度要及时达标，并维持相对较高水平，一般大于8 μg/L。去致敏治疗过程中可适当给予小剂量他克莫司和麦考酚钠免疫抑制，以协助抑制HLA抗体产生。应用IBM SPSS 23.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以x±s描述，应用t检验；符合偏态分布的计量资料以M（Q1，Q3）表示，应用秩和检验；P<0.05为差异有统计学意义。26例高致敏受者行术前降抗体治疗。其中男性8例，女性18例。11例受者有肾移植手术史，9例有输血史。18例女性受者均有妊娠史，其中6例有多次妊娠史。共计完成280例次免疫吸附治疗，受者最少行5次治疗，最多行25次治疗，治疗次数为（10.76±5.53）次。以最高MFI位点计算，免疫吸附治疗前，受者HLA⁃Ⅰ类抗体MFI从免疫吸附治疗前的17 921±4 442下降到治疗后的7 333±6 434，下降率为59%；HLA⁃Ⅱ类抗体MFI从21 135±5 245下降到治疗后的10 989±7 627，下降率为48%，免疫吸附治疗前后比较，差异均有统计学意义（P值均<0.001，表1）。但也有个别受者下降不明显：以例11为例，受者在10次免疫吸附后，最高HLA⁃Ⅰ类抗体水平从24 086下降至23 270，仅下降3.39%；HLA⁃Ⅱ类抗体从24 860下降至23 724，仅下降4.57%（表1）。进一步行免疫吸附洗脱液HLA抗体水平检测以及倍比稀释法稀释抗体后再次检测结果见表2及表3。表1 26例去致敏治疗受者免疫吸附治疗前后HLA抗体最高平均免疫荧光强度变化
表2 例11受者免疫吸附治疗前后血清及洗脱液HLA抗体免疫荧光强度变化
表3 倍比稀释法检测例11受者HLA抗体平均免疫荧光强度结果
例11受者经过10次免疫吸附后，MFI>20 000的强阳性HLA⁃Ⅰ类抗体MFI最高下降率为3.39%，HLA⁃Ⅱ类抗体最高下降率为4.57%；甚至有抗体反跳情况，如A0206位点的MFI经过免疫吸附治疗反而由24 073上升至24 099，DQ0402位点的MFI也同样由治疗前的23 359上升至23 688。MFI<20 000的HLA⁃Ⅰ类抗体MFI最高下降率为72.44%（B4601从治疗前4 886下降至治疗后1 346），HLA⁃Ⅱ类抗体最高下降率为40.74%（DR1303从治疗前6 052下降至治疗后3 587）。（表2）通过倍比稀释检测该受者最高MFI的HLA⁃Ⅰ类抗体A0301位点发现在经过1∶32倍稀释后抗体下降率仅为24.6%（由稀释前24 086下降至18 150），经过1∶64倍稀释后抗体才有较为明显下降，下降率为62.9%（由24 086下降至8 935）；而HLA⁃Ⅱ类抗体DQ0401位点经过1∶64倍稀释后抗体下降率仅为9.5%（由24 860下降至22 486），经过1∶128倍稀释后抗体下降率为20.7%（由24 860下降至19 710）。（表3）26例受者中，4例经去致敏治疗后达到术前虚拟配型阴性（手术前末次HLA抗体检测结果无DSA），其中1例完全避开所有既往HLA抗体，3例通过免疫吸附清除HLA抗体后未检测到DSA；其余22例受者均存在预存DSA，DSA的MFI由治疗前的9 922±6 728下降至治疗后2 009±2 582，下降80%，前后比较，差异有统计学意义（P<0.001，表4）。表4 受者预存供着特异性抗体的变化情况和移植肾预后情况
26例受者中，有7例（26.9%）在围手术期发生急性AMR，其中2例经活检证实，5例为临床诊断，经过继续免疫吸附治疗后早期排斥逆转；但其中2例为反复慢性排斥反应，虽经过积极治疗，但仍分别在术后3个月及术后12个月因移植物丢失再次透析。无受者围手术期发生细胞介导的排斥反应。发生肺部感染3例，均经过抗感染治疗得到控制，但其中1例因重症感染撤减抗排异药物后发生排斥反应，移植物丢失；2例出现较严重的骨髓抑制，白细胞下降，血小板降低，经过对症支持治疗后好转；未见其他严重不良事件，无明显出血，无病毒感染等。26例受者随访时间为（30.8±12.6）个月，移植肾丢失3例，移植肾存活率为88.5%（23/26），该3例移植肾丢失均发生在术后1年内，1年后受者未再次出现AMR，移植肾功能长期稳定，无受者死亡，受者存活率为100%（26/26）。HLA抗体水平是影响致敏受者肾移植手术成功的关键因素[2]，HLA抗体导致急性AMR的发生率增加，移植肾丢失率明显增加[4⁃5]，而目前降低HLA抗体水平的手段非常有限，寻求有效安全的治疗方法是目前亟待解决的问题。免疫吸附技术是一种较为新颖的技术，国内尚未广泛开展，其原理为利用SPA特异性与人体免疫球蛋白结合，降低人体循环中免疫球蛋白，以降低HLA抗体水平[13⁃14]。本研究发现，免疫吸附治疗后受者的HLA抗体MFI水平较治疗前明显下降，为后续肾移植配型创造了良好条件。还有研究发现，在同等血浆处理量情况下，与血浆置换技术相比，免疫吸附能更大程度地降低HLA抗体水平[19⁃20]。因此本研究认为免疫吸附是一种能有效降低HLA抗体水平的手段。同时，本研究也观察到免疫吸附后部分受者HLA抗体水平下降不明显，但对应位点免疫吸附洗脱液的抗体MFI与治疗后对应位点血清MFI一致，表明通过免疫吸附，血清中的大部分抗体已经被清除，但血清中抗体下降不明显则可能与抗体过饱和现象有关[21]。Pinelli等[22]报道现行的HLA抗体水平检测方法有一定局限性，MFI的数值计算是半定量的，存在抗体过饱和现象，当抗体水平达到检测上限后，MFI则不会再增加。本研究通过倍比稀释法对这部分高强度抗体的检测结果也验证了这一观点，当抗体MFI超过20 000时，受者实际抗体水平远远大于检测值，需要经1∶32倍稀释，甚至1∶128稀释后，抗体MFI才能检测出较为真实的结果。因此不能凭借过饱和抗体MFI变化来判断免疫吸附效果，对比同期洗脱液中存在大量对应位点的HLA抗体，说明已有大量HLA抗体被吸附清除，可以参考同期MFI为10 000至20 000的中等强度抗体的MFI变化，如本研究例11受者中等强度抗体在治疗后HLA⁃Ⅰ类抗体水平平均下降55%，HLA⁃Ⅱ类抗体平均下降25%，也证实了免疫吸附对于此类受者的HLA抗体清除也是有效的。在这种抗体过饱和情况下，可能需要更多次的免疫吸附治疗，才能缓慢降低抗体水平。另一方面，抗体下降不明显的可能原因是抗体生成速度过快，虽然本研究没有着重讨论该问题，但也需要引起重视，在去抗体治疗前需要使用一定的B淋巴细胞清除性药物（如利妥昔单抗）或浆细胞清除性药物（如硼替佐米、达雷妥尤单抗）等，否则可能会导致抗体下降后机体反馈调节，继而产生更多抗体。同时本研究观察到免疫吸附治疗前后受者HLA⁃Ⅰ类抗体的水平下降幅度大于HLA⁃Ⅱ类抗体，可能因为HLA⁃Ⅱ类抗体的MFI值普遍更高，更容易达到饱和状态，尤其是HLA⁃DQ抗体，而不是治疗本身对于这两类抗体清除有差别导致[19]。高致敏受者行肾移植手术，不可避免会出现预存DSA的情况[23]，本研究的26例受者中，移植时仅有1例无预存DSA；3例历史DSA阳性，通过去致敏治疗达到术前虚拟配型阴性；其余22例术前均有预存DSA，其中3例受者术前流式交叉配型弱阳性。高致敏受者术前流式交叉配型弱阳性行肾移植并非绝对禁忌[24]，但早期AMR的发生率明显增加，本研究中，受者早期急性AMR的发生率为26.9%（7/26），远高于普通肾移植受者。尽管有预存DSA的肾移植受者早期AMR的发生率、移植肾丢失率均高于普通受者，但对于高致敏受者，进行脱敏治疗以降低预存DSA水平仍是值得尝试的方案[25]，因为高致敏受者若一直追求无DSA，可能终身无法配型成功或配型等待时间过长，而长期透析带来的各种并发症也会导致不良结局的发生。已有文献报道，低抗体滴度的DSA对肾移植受者影响较小，渡过早期急性排斥反应阶段后，受者远期存活率与无DSA者差异不大，且远好于单纯透析的受者[9,24]。本研究发现，预存DSA的肾移植受者，术前末次DSA的MFI水平高者术后早期AMR的发生率增大，但术前DSA水平低者也存在术后DSA水平反跳现象，导致AMR的发生，这可能与受者体内存在长寿命效应的记忆B细胞有关。对于术后发生AMR的高致敏受者，免疫吸附同样能降低DSA水平，起到逆转排斥反应的作用。本研究中，7例术后发生急性AMR的受者中，经过免疫吸附治疗，急性AMR均得到有效控制。免疫吸附治疗后DSA水平维持在较低水平的受者预后较好。而DSA水平一直维持在高水平的受者，容易演变为慢性活动性排斥反应，从而导致移植肾丢失。但也存在部分HLA⁃Ⅱ类抗体，尤其是部分HLA⁃DQ抗体，虽然DSA水平持续较高，但未发生临床的活动性排斥反应，受者肾功能稳定，无明显蛋白尿。这可能跟抗体损伤组织能力有关，如补体C1q结合的DSA有更强的结合内皮细胞，损伤组织的能力，从而导致临床排斥反应的发生，因此需要更长时间观察以及更多的研究以探索抗体与排斥反应的关系[25⁃27]。在免疫吸附治疗的安全性方面，本研究中，受者的主要并发症是感染，尤其是肺部感染，可能是由于利妥昔单抗、大剂量激素和口服免疫抑制剂等因素引起的。虽然无法明确感染发生的特定原因，但免疫吸附治疗后，受者外周血免疫球蛋白水平下降，受者被动抵抗力下降的情况下，必然导致受者感染风险的增加。因此必要时可使用IVIG治疗，一方面增加被动免疫，另一方面抑制HLA抗体的反馈性增加。本研究尚存在一些不足之处：（1）本研究受者在术后AMR的诊断缺乏病理证据支持，仅2例行移植肾穿刺活检，主要原因为担心出血风险，一方面肾移植术后早期存在手术出血风险；另一方面，免疫吸附治疗的血液体外循环需要使用抗凝药物，也增加了出血风险；（2）本研究为单中心数据总结，病例数量较少且缺乏同期的对照组，仍需要开展大型前瞻性多中心临床试验研究；（3）仅关注受者围手术期并发症，远期感染（如多瘤病毒感染、耶氏肺孢子菌肺炎、巨细胞病毒感染等）未进行完整总结；（4）本研究中部分肾移植受者存在DSA，虽然经过免疫吸附治疗DSA的MFI水平下降，肾功能稳定，但大多数受者并未达到DSA的完全清除，且随访时间较短，远期抗体反弹及AMR的发生尚待进一步随访观察。综上所述，本研究发现，对于高致敏肾移植受者，免疫吸附无论在术前去致敏降低抗体治疗中还是术后发生排斥反应后的抗排斥治疗中，都能有效降低HLA抗体水平，从而增加肾移植手术的成功率，逆转排斥反应，保证移植肾功能的恢复。在安全性方面，免疫吸附治疗可能增加潜在的感染风险，尤其是围手术期的感染风险，联合抗排斥药物及B淋巴细胞及浆细胞清除性抗体后感染风险进一步增加，需要引起进一步的重视。作者贡献声明
黄浩杰：实施研究、分析数据、论文撰写；丁洁、胡雨婷：采集数据、分析数据；宋诞、祝敏、王枫、郑恒、黄陈洁：实施研究；邹庆玲：研究指导、实施研究；寿张飞：研究指导、实验设计、论文修改、经费支持黄浩杰,丁洁,胡雨婷,等. 免疫吸附在高致敏肾移植受者围手术期应用的单中心经验总结[J]. 中华器官移植杂志,2024,45(10)：702-709.
DOI:10.3760/cma.j.cn421203-20230928-00107
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