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间充质干细胞衍生的外泌体促进组织再生在心胸外科领域的研究进展
万昊鑫 夏天 沈子青 潘枢 丁成 赵军
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教授、苏州大学专业和学术型博导、主任医师
苏州大学附属第一医院大外科副主任,胸外科行政科主任
苏州市癌症分子遗传学（重点）实验室副主任
江苏省医师协会胸外科医师分会第三届副会长
中国转化医学联盟细胞生物学分会副会长
江苏省抗癌协会食管癌专业委员会第四届副主任委员
江苏省老年医学学会胸外科分会副主任委员
江苏省医学会胸外科分会常务委员
江苏省研究型医院肺癌和肺结节MDT专委会副主任委员
苏州市医学会胸外科专业委员会主任委员
苏州市医学会结核病学专业委员会副主任委员
【摘 要】 随着再生医学的不断发展，间充质干细胞衍生的外泌体（mesenchymal stem cell⁃derived exosome，MSC⁃Exo）凭借其促进组织再生、生物相容性好、易于深入组织等优点越来越受到研究人员的青睐，其具体机制也越发成为研究热点。在心胸外科领域，有关MSC⁃Exo的作用也已逐渐受到重视，目前在心脏病领域、肺疾病领域、肺移植领域以及气管移植与食管修复领域均有相关研究。本文对现有的关于MSC⁃Exo在心胸外科领域的研究以及其机制与结果进行了系统的整理以期为未来更多的相关研究提供参考。近年来间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）及其衍生的外泌体越来越受到再生医学领域研究的重视[1]。MSC是具有自我更新和存在多系分化能力的细胞。研究表明，将MSC应用于临床可以促进组织修复或再生、降低炎症反应，抑制细胞凋亡[2]。然而，单纯的应用MSC进行治疗要面临供者年龄限制、免疫原性等问题[3]。因此研究人员将目光聚焦到间充质干细胞衍生的外泌体（mesenchymal stem cell⁃derived exosome，MSC⁃Exo）上，发现使用MSC⁃Exo可以起到同样甚至更好地治疗效果并避免了单纯应用MSC的缺点[4]。外泌体于1987年首次在绵羊网织红细胞中被发现，是包含了复杂蛋白质、脂质和RNA的大小为50~150 nm的细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）[5]。其相比于单纯的应用MSC有如下的优势：首先，外泌体体积较小，可以更好的作用于靶组织且可以有效避免MSC进入体内各组织分布不均的问题；第二，外泌体具有良好的生物稳定性，可以修饰并装载有效的药物；第三，外泌体具有较低的免疫原性不易出现免疫排斥；第四，外泌体还可以具有跨物种使用特性，为大规模生产提供可能[6]。目前MSC⁃Exo在心胸外科领域的研究已涉及心肌梗死、肺纤维化以及支气管发育不良等多种急慢性疾病并且在肺移植、气管移植以及食管修复方面也有研究[6]。最常见和最传统的外泌体分离方法是超速离心/差速超速离心分离法，其原理是根据大小和密度分离外泌体[7]。这种技术相对具有成本较低和安全性可靠的优点，然而其缺点是缺乏特异性，因为分离的外泌体可能包含其他类似大小的细胞外囊泡。为了解决这个问题，除了差速超速离心分离法外，还可以建议使用碘克沙醇或蔗糖垫层。超滤是另一种用于分离外泌体的传统方法，其可以根据其分子量分离出外泌体。然而，其主要缺点与超离心类似，很难过滤其他大小与外泌体相似的化合物从而影响提取纯度[8]。尺寸排除色谱法（size exclusion chromatography，SEC）可以根据尺寸或分子量分离外泌体。SEC可高纯度分离外泌体，并作为外泌体纯化过程中的基本工具，并且SEC还可以与超离心或其他技术结合使用，使得外泌体生产具有更高的效率[9]。在提纯方面，免疫色谱法常用于提高分离外泌体的纯度。在这项技术中，外泌体可被免疫亲和蛋白及其特异性抗体捕获到色谱柱上[10]，从而达到提纯的目的。在新技术方面，近年来开发了微流控分离技术，该技术可以用于快速有效地从生物样品中分离提纯外泌体且可以显著减少试剂消耗、样品量、分离成本和分离时间。微流控分离技术可分为基于物理的微流控技术以及基于免疫亲和力的微流控技术[11]。基于物理的微流控分离设备通常通过纳米孔膜、纳米过滤器、微绒毛、声场和电场来主动或被动的捕获外泌体，而基于免疫亲和力的微流控设备依赖于抗原⁃抗体反应来分离特定的外泌体。因此，关键因素是选择合适的抗体，促进微尺度传质和增加颗粒表面碰撞（或增加接触表面积）[12]。在大多数情况下，免疫亲和力捕获外泌体可以通过固定的抗体涂层介质和移动抗体涂层介质来实现。MSC⁃Exo通常采用电子显微镜观察、纳米颗粒追踪分析技术（nanoparticle tracking analysis，NTA）和表面特异标志物鉴定等方法相结合进行鉴定[13]。电子显微镜可以直接观察到MSC⁃Exo的形态，其多为明显的脂质双层膜圆形结构，直径约为150 nm。NTA可对提取的MSC⁃Exos进行粒径分析，进一步确定其是否符合外泌体的特征[14]。MSC⁃Exo的表面特异标志物通常采用免疫印迹进行鉴定，其可以准确的检测出外泌体标志蛋白TSG101及Alix等的表达从而分离所得的是否为外泌体[15]。当前MSC⁃Exo在心脏疾病领域研究最为广泛且深入的就是在心肌梗死方面。心肌梗死是由于冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死[16]。目前对于心肌梗死主要的治疗方法为药物化解治疗、药物溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗、外科搭桥治疗等。但是这些疗法难以快速挽救濒死的心肌，从而缩小心肌梗死的面积，所以在面对高龄以及大面积急性心肌梗死的患者往往死亡率较高[17]。由于外泌体具有促进血管增殖、细胞再生和增强细胞活力的作用，近年来许多研究将焦点聚集在外泌体对动物模型心肌梗死的治疗上。Mao等[18]将40 μg人MSC⁃Exo通过静脉注射的方式导入经处理的心肌梗死大鼠体内，发现大鼠心肌梗死的面积减小、炎症减轻。该研究发现其可能的机制为MSC⁃Exo增加lncRNA KLF3⁃AS1的表达，通过捕捉miRNA⁃138⁃5p来调节Sirt1的表达进而抑制细胞凋亡并减小梗死面积。同年Ni等[19]向心肌梗死大鼠心肌内注射50 μg经TIMP2修饰的脐带MSC⁃Exo，结果发现心肌梗死大鼠的心功能得到改善，心肌梗死面积缩小（P<0.05），其可能的机制为TIMP2过度表达的脐带MSC⁃Exo增加了抗凋亡bcl⁃2基因的表达，并降低了心肌中促凋亡bax基因和Caspase⁃9基因的表达从而抑制心肌凋亡并缓解心梗。2年后，Yang等[20]选取人类的MSC⁃Exo和大鼠的心脏微血管内皮细胞为实验材料，通过目的基因预测、转染、免疫印迹实验、定量逆转录聚合酶链式反应等实验对MSC⁃Exo减轻心肌梗死损伤的机制进行了探索。实验结果表明，MSC⁃Exo可通过其中的miR⁃543下调心脏微血管内皮细胞中的COL4A1增强其增殖、迁移和血管生成能力从而减轻心肌梗死的损伤。Liu等[21]、Lv等[22]和Zhao等[23]也通过后续实验证明了MSC⁃Exo对缩小心肌梗死面积、改善心功能有明确的治疗效果，其具体实验方法、结果以及可能机制见表1。综上，MSC⁃Exo对心肌梗死有肯定的治疗效果，但是其相关研究在现阶段还存在难以明确其复杂的机制以及缺乏临床实验等不足，有待进一步研究解决。表1 MSC⁃Exo在心肌梗死治疗的作用相关文献
注：MSC为间充质干细胞；MSC⁃Exo为间充质干细胞衍生的外泌体；MI为心肌梗死；UC⁃MSC为脐带间充质干细胞；BM⁃MSC为骨髓间充质干细胞；lncRNA为长链非编码RNA；TIMP为金属肽酶抑制因子；miRNA为微小RNA；MIF为巨噬细胞游走抑制因子
MSC及MSC⁃Exo在肺疾病领域主要应用于早期干预慢性肺疾病如慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）、特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）以及支气管肺发育不良（broncho⁃pulmonary dysplasia dysplasia，BPD）等的治疗[24]。目前，这些慢性肺疾病主要依靠药物治疗延缓其进展，其终末期只能通过肺移植进行治疗。MSC⁃Exo凭借其促进组织再生和减轻炎症反应的生物学特性有望在这些慢性肺疾病的治疗上取得突破。COPD是一种常见的肺部慢性疾病，其发生与不可逆气流阻塞和气道炎症相关。COPD对患者的呼吸产生不利影响并减弱患者的肺功能。据世界卫生组织预测，到2030年COPD将成为世界第三大发病和死亡原因[25]。目前对终末期COPD的主要治疗手段是肺移植，而MSC及MSC⁃Exo的再生作用为COPD的治疗开辟了新的路径。Harrell等[26]通过动物实验发现经过设计修饰的MSC⁃Exo可以通过减少肺浸润巨噬细胞、嗜中性粒细胞以及自然杀伤细胞和自然杀伤T淋巴细胞中炎症因子的产生，减弱肺浸润巨噬细胞和树突状细胞的抗原呈递特性的方式改善COPD模型小鼠的肺功能。该研究团队还在30例COPD患者中进一步研究了这种经过修饰的MSC⁃Exo的治疗潜力，研究结果表明，全部30例接受治疗的患者肺部状况都得到改善，这体现在第1秒用力呼气量（FEV1）与初始值相比有所提高，呼气峰值流速（PEF）提高，COPD临床呼吸问卷（clinical COPD questionnaire，CCQ）评分下降，以及6分钟步行距离（6MWD）增加。在另一项临床研究中，Armitage等[27]选取了9例中至重度COPD患者接受MSC及MSC⁃Exo静脉注射治疗，并通过炎症指标测定、胸部CT检查等评价其治疗效果，经过12个月的随访及分析发现，MSC通过其衍生的外泌体减少了肺部炎症，缓解了COPD并且未出现不良反应。IPF是一种不明原因的慢性纤维化性间质性肺炎，是间质性肺疾病中最常见和致命的一种。IPF患者的疾病特征是呼吸困难逐渐恶化，平均预期寿命仅为3~5年。IPF的发病机制可能与免疫炎症导致肺泡上皮细胞损伤有关，因此，利用外泌体促进细胞再生和增强细胞活力的特性将其应用于IPF的治疗是目前肺科疾病研究领域潜在的研究方向[28]。为此Mansouri等[29]向经博莱霉素处理过的IPF模型小鼠体内注射人骨髓MSC⁃Exo，实验结果证明外泌体可以通过重建正常的肺泡结构、减少胶原积累和降低细胞凋亡来减轻和解决博莱霉素诱导的纤维化，其机制可能为MSC⁃Exo通过调节单核细胞的表型来达到缓解肺纤维化的目的。Xu等[30]使用经气管内注入二氧化硅（SiO2）悬浮液处理的小鼠为动物模型，并向其体内注射人脐带MSC⁃Exo，实验发现小鼠的肺部损伤减轻且肺部炎症和纤维化好转。进一步研究表明，这种改善是由于脐带MSC⁃Exo减少了暴露于SiO2的NIH⁃3T3细胞中的胶原蛋白沉积导致的。此外，Shi等[31]、Zhou等[32]和Wan等[33]也通过后续的实验证明外泌体对IPF对治疗有明确且积极的作用。BPD是一种严重的肺部疾病，至今仍然是导致早产儿死亡的重要原因。对其发生途径的研究证实，炎症与细胞损伤是BPD演变的关键因素[34]。MSC及MSC⁃Exo具有抗炎以及促进肺泡发育的特性，因此在治疗BPD上越来越受到重视[35]。Porzionato等[36]通过气管内给药研究包含MSC⁃Exo在内的MSC细胞外囊泡（MSC extracellular vesicles，MSC⁃EV）在BPD大鼠模型中的保护作用，实验结果表明MSC与MSC⁃EV均可以减少高氧诱导的损伤且MSC⁃EV在肺泡化与肺血管化方面有着更好的表现，其主要通过减少肺巨噬细胞的数量来实现。此外，You等[37]发现，将人脐带MSC⁃EV（包含MSC⁃Exo）在气管内给药后药物被肺组织迅速吸收并保留近12 h，在此过程中刺激了肺血管的生成并且改善了BPD大鼠模型的肺动脉高压。其机制可能为MSC⁃EV通过保护与PTEN/Akt信号通路相关的TIIAEC和PVEC改善大鼠的BPD。Braun等[38]的一项研究也表明腹腔注射MSC⁃Exo可以保护新生大鼠模型中的肺泡化和血管生成从而改善大鼠的BPD，这是因为高氧期的外泌体治疗可防止肺泡生长中断，增加小血管数量并抑制p14，p21和p56导致的右心肥大。在这一领域，Willis等[39]和Ahn等[40]的研究也为不同来源的MSC⁃Exo可以改善BPD提供了有力证据，但是这些动物研究也存在着缺陷，因为大鼠与人类新生儿不同，人类新生儿早期的气管发育水平及其所处环境常不及大鼠，所以还需要更多临床实验来完善外泌体对BPD的治疗作用。上述肺疾病在组织与细胞层面的发病机制都存在肺泡细胞受损，炎症损伤等问题，MSC⁃Exo的促进组织再生和抑制炎症反应的能力可以起到缓解作用。有关MSC⁃Exo在肺疾病治疗的作用的更多研究见表2。表2 MSC⁃Exo在肺疾病治疗的作用相关文献
注：MSC⁃Exo为间充质干细胞衍生的外泌体；IPF为特发性肺间质纤维化；BM⁃MSC为骨髓间充质干细胞；UC⁃MSC为脐带间充质干细胞；NIH为美国国立卫生研究院；miRNA为微RNA；SOX4为核转录因子SOX4；DKK为Dickkopf WNT 信号通路抑制因子；TGF为转化生长因子；BPD为支气管肺发育不良；MSC⁃EV为间充质干细胞衍生的细胞外囊泡；TIIAEC为II 型肺泡上皮细胞；PVEC为肺血管内皮细胞；COPD为慢性阻塞性肺疾病；PL⁃MSC为胎盘来源的间充质干细胞；DC为树突状细胞
在肺移植领域中，肺缺血再灌注损伤（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）是接受移植的受者出现的严重并发症之一。MSC⁃Exo可以在发挥与MSC相当的减轻LIRI作用的同时避免细胞的免疫原性带来的风险。Lonati等[41]对MSC⁃Exo改善LIRI期间离体大鼠肺的分子表型进行了实验，结果表明，与未处理的肺相比，MSC⁃Exo处理的器官显示血管阻力降低和灌流液一氧化氮代谢物升高。MSC⁃Exo阻止了由缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）引起的肺三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）减少并上调了参与解决炎症和氧化应激的基因。Stone等[42]也对此问题进行了探索。实验结果表明，与单独的IR相比，IR后使用MSC⁃Exo处理的小鼠的肺泡灌洗液中促炎细胞因子（IL⁃17、TNF⁃α、CXCL1 和 HMGB1）减少，角质形成细胞生长因子、前列腺素E2和IL⁃10上调。因此，MSC⁃Exo可以减轻IR后的肺部炎症和损伤，为治疗移植后LIRI提供新思路。气管移植是当前器官移植的热门领域，而3D打印气管移植是目前气管移植领域的最新研究方向，以往的3D打印气管面临如上皮化缓慢导致重建的气管容易发生感染、术后早起容易发生梗阻等诸多问题[43]。虽然研究人员为解决快速上皮化等问题做了不少研究与尝试，但收效甚。Zhang等[44]为解决这一问题将外泌体应用于3D打印气管移植。研究人员充分利用外泌体促进气管基底细胞扩增的特性，使3D打印的双层组织工程气管迅速上皮化，从而打印出更加贴合的气管组织。虽然该研究使用的是3T3⁃J2细胞衍生的外泌体而非MSC⁃Exo，但是对MSC⁃Exo在气管移植领域的研究有重要参考价值。Zeng等[45]利用人牙龈MSC⁃Exo对气管缺损的兔进行实验，结果表明牙龈MSC⁃Exo可以调节炎症反应、促进血管生成并通过TGF⁃β1介导的JAK2⁃STAT1信号通路激活促进人体支气管基底上皮细胞的增殖和迁移从而使哺乳动物（兔）纤毛柱状上皮快速再生，进而为气管移植提供一种合理且有前途的方式。在食管方面，有关外泌体的研究也已被重视，虽然基于MSC⁃Exo的应用缺乏确切的研究，但利用人口腔黏膜上皮细胞衍生的外泌体对食管狭窄进行治疗的可行性已经得到证实。Sjöqvist等[46]从临床级口腔黏膜上皮细胞中分离提取出外泌体并将其局部应用于猪食道伤口，结果表明，口腔黏膜细胞衍生的外泌体对食道伤口的愈合有促进作用。虽然该实验并没有使用MSC⁃Exo，但我们推断使用MSC⁃Exo也可能起到预防食道狭窄的作用。虽然目前对于此领域的研究并不多，但这仍是一个有意义并等待被开发的课题。总之，MSC以及MSC⁃Exo由于其强大的抗炎和促进组织再生能力在各个学科领域已经受到广泛重视。但其在临床应用上还面临一些困难和挑战，如外泌体分离的成本较高、难以长期保存、应用的浓度标准和质量控制等问题，相信随着研究的深入这些困难将会逐步解决。目前，关于MSC⁃Exo在心胸外科领域的潜在应用价值正在被发掘，但是相关研究并不广泛、多局限于动物实验且机制较为复杂。由于外泌体成分复杂，各种机制均可以起到治疗作用，目前难以明确起关键作用的机制。未来的基础研究方面可以将系统的梳理各项机制为切入点，通过深入分析MSC⁃Exo中miRNA、外泌体蛋白等具体成分的作用，明确外泌体促进组织再生的关键机制，从而更好的提升外泌体药物的有效性并降低其副作用。在科研成果向临床转化方面，可以将MSC⁃Exo应用于组织工程等领域，充分利用MSC⁃Exo促进组织再生的特点，开发出负载MSC⁃Exo的可以快速血管化、上皮化的组织工程气管、食管等组织，也可以将MSC⁃Exo应用于药物传递系统，利用其促进组织再生及低免疫原性的特点，通过MSC⁃Exo装载多种药物、大分子和其他物质，从而更加精准高效的投递药物。综上所述，MSC⁃Exo凭借其促进组织再生、生物稳定性好和免疫原性低等特点，在心胸外科领域有着广泛的发展前景。万昊鑫,夏天,沈子青,等. 间充质干细胞衍生的外泌体促进组织再生在心胸外科领域的研究进展[J]. 中华器官移植杂志,2024,45(8)：558-563. DOI:10.3760/cma.j.cn421203-20231019-00134.
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