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供肝胆管反应在肝移植疗效评价中的应用价值研究
胡鑫豪1 蓝天辰2 陈键3 戚浙拓1 高逢强1 陈昊4 董立彬1 阳新宇1
1. 浙江大学医学院器官移植研究所，杭州 310003；2. 浙江中医药大学第四临床医学院，杭州 310053；3. 杭州医学院，杭州 310059；4. 清华大学附属北京清华长庚医院肝胆胰中心，北京 102218；5. 树兰（杭州）医院，杭州 310022
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教育部“长江学者奖励计划”特聘教授
国家杰出青年科学基金获得者
国家“万人计划”科技创新领军人才
中华医学会器官移植学分会候任主任委员、肝移植学组组长
中国医师协会器官移植医师分会副会长、总干事
国家肝脏移植质控中心副主任、国家OPO质控中心副主任
中国抗癌协会肿瘤精准治疗专业委员会副主任委员
中国抗癌协会肿瘤转移专业委员会副主任委员
浙江省抗癌协会肿瘤精准诊治专业委员会主任委员
浙江省医学会器官移植学分会候任主任委员
国家科技进步创新团队奖、一等奖及二等奖主要完成人
中国肿瘤青年科学家奖、吴孟超医学青年基金奖获得者
杭州医学院副校长、浙江大学转化医学研究院副院长
【摘 要】目的研究供肝胆管反应在肝移植疗效评价中的作用。
方法回顾性收集2015年1月至2020年12月100例在树兰（杭州）医院接受肝移植手术受者及其相应供者临床资料，根据是否接受脂肪变性供肝将其分为肝脂肪变性组（HS组，65例）和非脂肪变性组（non⁃HS组，35例），根据是否发生早期移植物功能不全（early allograft dysfunction，EAD）分为（EAD组，33例）和非EAD组（non⁃EAD组，67例）。用免疫组织化学染色标本中细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）阳性胆管细胞所占染色面积百分比定义胆管反应程度（用DR值表示）。分析比较HS组和non⁃HS组、EAD组和non⁃EAD组供肝的DR值，利用单因素及多因素Logistic回归分析，确定EAD的危险因素；根据受者接受的供肝胆管反应程度（DR=0.4为临界值）结合其是否为脂肪变性供肝进行亚组分析，评价脂肪变性供肝中胆管反应程度对肝移植术后EAD发生率和生存的影响。
结果HS组（65例）供肝DR（0.59%±0.385%）高于非脂肪变性供肝（0.32%±0.194%）（P<0.01），EAD组供肝DR（0.72%±0.449%）高于非EAD组供肝（0.38%±0.226%）（P<0.01）。多因素Logistic回归分析提示供肝高胆管反应是移植术后发生EAD的独立危险因素。亚组分析结果提示，接受脂肪变性且低胆管反应程度（DR<0.4%）供肝与接受非脂肪变性供肝移植后受者EAD的发生及生存相当。
结论低胆管反应程度的脂肪变性供肝可安全用于肝移植，结合供肝胆管反应程度的移植肝损伤评价新体系可有效拓展脂肪变性供肝的临床应用。
【关键词】肝移植；脂肪变性供肝；胆管反应；早期移植物功能不全；预后肝移植是终末期肝病最有效的治疗手段，供肝短缺是目前肝移植领域的瓶颈。近年来，随着供体肝脏来源的拓展，脂肪变性供肝等扩大标准供体（extended criteria donor，ECD）相继应用于临床，有效缓解了供肝短缺问题。然而，脂肪变性供肝的应用也进一步增加移植术后早期移植物功能不全（early allograft dysfunction，EAD）等并发症风险，影响肝移植受者的预后。因此，如何精准评估脂肪变性供肝损伤程度，合理使用具有脂肪变性的扩大标准供肝，对供肝短缺背景下脂肪变性供肝的临床应用具有重要意义。胆管反应被认为是肝脏损伤发生发展中重要病理表现，通常表现为胆管细胞的不规则扩增，基质的变化和炎症的浸润[1]。本研究通过系统研究100例在树兰（杭州）医院接受脂肪变性与非脂肪变性供肝的肝移植受者临床参数和预后资料，提出反映供肝损伤程度的新指标，探索供肝中胆管反应与受者预后的新联系，为脂肪变性供肝的临床应用开辟新视野。本研究共纳入2015年1月至2020年12月在树兰（杭州）医院接受肝移植手术治疗的100例肝移植受者和与其配对的100例供者作为研究对象（供者数据来自国家卫生健康委员会多器官联合移植研究重点实验室）。所有受者随访时间自肝移植手术之日起至2020年12月31日，随访时间48 个月（24~72 个月）。纳入标准：接受心脏死亡供者（donor of cardiac death，DCD）供肝的受者；供肝病理学检查提示大泡型脂肪变性程度在0~35%；临床病理资料完整。排除标准：供者年龄超过60岁；术后组织病理学检查证实为胆管细胞癌或混合型肝细胞癌；儿童肝移植；劈裂式肝移植；多器官联合移植；二次肝移植；临床病理资料缺失；术后供肝血流异常。本研究通过树兰（杭州）医院科研伦理委员会伦理审批（伦理号：KY2021014）。收集100例供肝的组织样本进行后续组织病理学分析，由手术医师在移植前切取，取下的样本部分保存于福尔马林中固定，后续进行脱水石蜡包埋，用于组织病理学检查；部分置于冻存管中，并迅速于液氮中保存，用于实验室检查。组织样本取自石蜡包埋组织。100例肝移植全部采用经典原位肝移植术或改良背驮式肝移植。术后常规免疫抑制剂方案为：他克莫司+吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）+甲泼尼龙，用药同时监测血药浓度，后续根据不同个体情况适当调整药物剂量。他克莫司的起始剂量为0.1 mg·kg–1·d–1（2次/d），术后1个月维持他克莫司浓度为8~12 μg/L，第2个月维持在5~8 μg/L。MMF的起始剂量和维持剂量均为1 g/d（2次/d）。甲泼尼龙的起始剂量为240 mg/d（2次/d），并按20 mg/d剂量递减至术后1个月停用。观察指标：分析比较肝移植受者的预后情况，包括移植术后EAD发生率、总生存时间；分析影响受者预后的危险因素，包括供受者年龄、性别、体重指数、终末期肝病模型（model for end stage liver disease，MELD）评分，供肝脂肪变性程度、胆管反应程度，供肝冷缺血时间、热缺血时间，总手术时间及术中出血量等[2]。移植术后EAD判定标准为：术后第7天胆红素总量≥1 g/L；术后第7天国际标准化比率（INR）≥1.6；术后7 d内丙氨酸转氨酶（ALT）或天冬氨酸转氨酶（AST）≥2 000 IU/ml[3]。供肝脂肪变性程度依据《中国肝移植供肝获取技术规范（2019版）》[4]。受者生存时间定义为手术至受者死亡或随访截止时间。胆管反应程度（用DR值表示）定义为免疫组织化学染色标本中细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）阳性胆管细胞所占染色面积百分比[5]。本研究使用SPSS 23.0、GraphPad Prism 9.5和ImageJ 1.53e版本软件进行数据统计学处理。免疫组织化学染色阳性面积使用ImageJ进行量化。正态分布的计量资料以![]()
表示，偏态分布的计量资料以M（IQR）表示，计数资料以绝对数表示。采用Kaplan⁃Meier分析计算存活率和绘制生存曲线，组间比较采用![]()
2检验。各项分析中P<0.05为差异有统计学意义。单因素分析中差异有统计学意义的指标纳入多因素Logistic回归分析，公式如下：S（t）=S（t⁃1）[1⁃d（t）/n（t）]、![]()
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（O⁃![]()
）²/E、log（odds）=β0+β1X、log（odds）=β0+β1X1+β2X2+…+βnXn。统计结果由两位统计学专业人士进行分析。本研究纳入的100例肝移植受者中，接受轻、中度脂肪变性（大泡型脂肪变性程度在0~35%）供肝的65例，接受非脂肪变性供肝35例。根据是否接受脂肪变性供肝将100例受者分为脂肪变性供肝组（HS组，65例）和非脂肪变性供肝组（non⁃HS组，35例）。HS组移植物重量大于non⁃HS组（P<0.01，表1）；HS组的EAD发生率高于non⁃HS组（40%比20%，P=0.042，表1）。两组在受者相关因素（性别、年龄、体重指数、MELD评分）、供者相关因素（性别、年龄、体重指数）、移植手术相关因素（冷缺血时间、热缺血时间、术中出血量）之间的差异均无统计学意义（均P![]()
0.05，表1）。表1 脂肪变性供肝组和无脂肪变性供肝组的一般资料比较
本研究纳入的100例受者中有33例发生EAD，根据是否发生EAD分为EAD组（33例）和非EAD组（non⁃EAD，67例）。两组一般资料比较，其中EAD组供肝胆管反应程度高于non⁃EAD组（P<0.01），两组在供者年龄（P=0.003）、供肝有无脂肪变性（P=0.042）、受者MELD评分（P=0.048）和冷缺血时间（P=0.034）方面的差异也有统计学意义，而在供者性别、体重指数、供肝大泡型脂肪变性程度、移植物重量、受者性别、年龄、体重指数、热缺血时间和术中出血量等方面的差异均无统计学意义。（表2）HS组DR高于non⁃HS组（P<0.01，表1）。H&E染色结果提示，HS组供肝的肝细胞内可见脂肪滴，细胞中细胞核等细胞器被挤至一边，可见细胞内出现大小不一的空泡；non⁃HS组供肝的肝细胞排列规则，细胞核位于中央（图1A）。免疫组织化学染色结果提示HS组供肝DR=0.59%±0.385%，non⁃HS组供肝DR=0.32±0.194 %，HS组的胆管反应更明显（P<0.01，图1B⁃1C）。![]()
图1 HS组与non⁃HS组肝移植受者供肝胆管反应病理图 A.HS组与non⁃HS组肝移植受者供肝H&E染色（比例尺=50 µm，×200倍）；B.HS组与non⁃HS组供肝的CK19免疫组织化学染色（比例尺=50 µm，×200倍）；C.100例HS组（35例）与non⁃HS组（65例）肝移植受者供肝的CK19阳性面积比例统计图注：HS为脂肪变性；DR为胆管反应程度；a表示P<0.01
H&E染色结果提示EAD组供肝中可见大量免疫细胞浸润，部分肝细胞内出现大小不一的空泡（图2A）；non⁃EAD组供肝的肝细胞排列规则，细胞核位于中央。免疫组织化学染色结果提示EAD组供肝（DR=0.72%±0.449%）较non⁃EAD组供肝（DR=0.38%±0.226%）的胆管反应更明显（P<0.01，图2B⁃2C）。![]()
图2 EAD组与non⁃EAD组肝移植受者供肝的胆管反应病理图 A.EAD组与non⁃EAD组肝移植受者供肝的H&E染色（比例尺=50 µm，×200倍）；B. EAD组与non⁃EAD组肝移植受者供肝的CK19免疫组织化学染色（比例尺=50 µm，×200倍）；C. EAD组与non⁃EAD组相应供肝的CK19阳性面积比例统计图注：EAD为早期移植物功能不全；DR为胆管反应程度；HS为脂肪变性；a表示P<0.01
单因素Logistic回归分析显示影响肝移植受者EAD发生的危险因素为：供者胆管反应程度、移植物冷缺血时间、移植物重量、受者MELD评分（均P<0.05，表3）；进一步多因素Logistic回归分析显示供肝胆管反应程度、移植物冷缺血时间、移植物重量是影响肝移植受者EAD发生的独立危险因素（均P<0.05，表3）。根据供肝胆管反应程度的中位数，将供肝分为高DR组（DRhi组，DR≥0.4%，49例）和低DR组（DRlo组，DR<0.4%，51例），并进一步结合其有无脂肪变性分为四个亚组：DRhi+HS组（38例）、DRlo+HS组（27例）、DRhi+non⁃HS组（11例）、DRlo+non⁃HS组（24例）。结果提示：DRhi+HS组中有20例（52.63%）发生EAD，DRlo+HS组有6例（22.22%）发生EAD，DRhi+non⁃HS组中有5例（因该组总例数较小，不做百分比和统计学比较）发生EAD，DRlo+non⁃HS组中有2例（8.33%）发生EAD。DRhi+HS组较DRlo+HS组EAD发生率高（52.63%比22.22%，P<0.01）；DRlo+HS组较DRlo+non⁃HS组EAD发生率高（22.22%比8.33%，P=0.006）。此外，DRlo+HS组和non⁃HS组比较，EAD发生率差异无统计学意义（22.22%比20%，P=0.728）。进一步对接受上述不同亚组供肝的受者进行生存分析，结果提示各组中位生存时间为：DRhi+HS组8.9个月，DRlo+HS组23个月，DRhi+non⁃HS组1.2个月，DRlo+non⁃HS组38.9个月。DRhi+HS组较DRlo+HS组受者总存活率更低（P=0.004，图3）；DRlo+HS组与DRlo+non⁃HS组受者的总存活率差异无统计学意义（P=0.912，图3）。![]()
图3 供肝胆管反应程度对肝移植受者术后生存的影响注：HS为脂肪变性；non⁃HS为非脂肪变性；DRhi为胆管反应≥0.4%；DRlo为胆管反应<0.4%
我国是肝病的高发国，各类肝脏疾病均可进展至终末期肝病[6⁃7]。肝移植是终末期肝病最有效的治疗手段，而器官短缺这一难题严重限制了我国肝移植事业的发展[8]。因此，如何科学使用扩大标准供肝是一个亟待解决的关键问题[9⁃10]。近年来，代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）的发病率逐渐升高，这无疑增加了脂肪变性供肝的比例，进一步增加了植术后EAD的风险[11⁃12]。本研究团队前期研究发现受者术前体重指数≥25 kg/m2且合并高血压病或糖尿病，接受脂肪变性供肝后的早期存活率明显降低[2]，提示脂肪变性供肝的应用会影响肝移植疗效。胆管反应作为脂肪变性肝脏的重要病理学改变，其与肝纤维化和肝脏门脉区炎症密切相关，提示胆管反应可用于评估脂肪变性肝脏的不同损伤程度[13⁃14]。但目前尚无关于胆管反应与肝移植术后疗效评价的相关研究。本研究首次提出胆管反应程度可作为评估轻、中度脂肪变性供肝损伤程度的指标，并可对轻、中度脂肪变性供肝移植术后EAD的发生进行预警与预测，为进一步拓展脂肪变性供肝的临床应用提供了新的优化策略。EAD是肝移植术后的早期并发症，主要表现为移植术后短期出现ALT/AST、胆红素升高和凝血功能不良等，严重影响移植物存活与受者生存[15⁃16]。既往国内外研究报道，供肝脂肪变性是肝移植受者发生EAD的危险因素[2,17]。随着脂肪变性供肝的大量应用，寻找精准预测脂肪变性供肝移植术后EAD发生的有效指标至关重要。近年来，血清细胞因子和趋化因子、凝血因子、肝脏微循环和保存液中的微小RNA（microRNA）等都被引入作为预测EAD的相关指标[18⁃19]。然而由于这些参数大部分只能在受者移植物血运重建后确定，这会使其受到术后EAD的影响而干扰准确性，因此在目前临床实践中很少使用这些参数预测术后EAD发生。胆管反应是肝脏损伤引起的反应性胆管的扩增，主要病理表现为免疫细胞大量浸润，胆汁淤积和肝纤维化等特征改变[20⁃21]，临床上可通过对CK19进行免疫染色快速判定。研究报道胆管反应在非酒精/酒精性脂肪肝等各种肝脏疾病中都很常见[22]。其可通过释放促炎介质，导致中性粒细胞和淋巴细胞积累，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活和新血管形成，进而引起损伤修复的异常反应[13,23⁃24]。本研究发现，相比于非脂肪变性供肝，脂肪变性供肝具有更高胆管反应程度（P<0.01），这提示脂肪变性供肝的肝脏损伤更加严重。进一步通过对胆管反应程度和EAD发生率的分析发现，供肝胆管反应程度越高其EAD发生率越高（P<0.01）。单因素和多因素分析结果表明胆管反应程度和移植物冷缺血时间等都是EAD发生的独立危险因素。相比于其他用于预测EAD的标记物，胆管反应可以在受者移植物血运重建前观察，这就避免了术后EAD发生对预后的影响。同时，由于供肝胆管反应检测过程简单快捷，也为肝移植预后的无创评估提供了新思路。值得一提的是当把脂肪变性供肝根据胆管反应程度进行分级后，DRlo（DR<0.4%）组的脂肪变性供肝与非脂肪变性组的受者术后EAD发生率和总存活率相当，这表明当不可避免地接受脂肪变性供肝进行肝移植时，可优先选择胆管反应低的供肝，其可获得与非脂肪变性供肝相当的疗效。基于以上结果，供肝胆管反应程度可作为预测肝移植术后EAD发生及评价受者预后的新指标。本研究发现胆管反应程度更高的供肝具有更高的EAD发生率，其主要机制可能有以下几方面。首先，胆管反应与肝脏炎症浸润密切相关[25]。研究报道胆管反应可以触发成纤维细胞活化并影响炎症细胞募集，从而导致肝脏损伤进展的恶性循环[26⁃27]。其次，肝细胞的衰老也与胆管反应存在关联。研究发现在慢性肝损伤患者的肝脏组织中，肝细胞P21（细胞衰老标志物）的表达水平与胆管反应程度成正相关[28]。衰老的细胞往往存在DNA损伤，提示肝细胞在有丝分裂过程中可能发生胞质分裂障碍，进而发生细胞周期阻滞并抑制肝细胞的增殖和肝脏再生，这可进一步解释发生EAD的移植肝脏再生能力降低[29⁃32]。另外，本研究结果表明胆管反应与移植物冷缺血时间都是移植术后EAD发生的独立危险因素。深入研究发现，供肝胆管反应程度反映移植肝脏在供者体内的损伤，而移植物冷缺血时间则一定程度代表供肝在离体后的损伤，冷缺血时间延长所致的缺血再灌注损伤也会引起胆管反应程度增加[33]，这提示将两者相结合或可更精准评估供肝损伤程度，值得未来进一步探索。本研究也存在一定局限性。由于样本数量有限，研究未对入组病例进行倾向性评分匹配，可能会存在其他混杂因素对结果产生影响，如供肝冷缺血时间较长时，供肝胆管反应程度也会随之增加[34]。后续将会扩大样本量，进行倾向性评分匹配，尽可能避免其他影响因素，同时把肝移植术后的影响因素也纳入研究。本研究也为临床更科学使用扩大标准供肝提供新的理论依据。根据胆管反应程度对脂肪变性供肝进行划分，可以更科学地评估供肝损伤程度，提升肝移植疗效。此外，也可结合胆管反应程度对其他扩大标准供肝进行功能评估，如结合胆管反应程度对老年供肝进行评估，可有效拓展老年供肝的使用。综上所述，胆管反应可作为反映脂肪变性供肝损伤程度的重要指标，结合胆管反应的供肝损伤评价新体系可进一步优化脂肪变性供肝的临床应用。对低胆管反应（DR<0.4%）的脂肪变性供肝，其可获得与非脂肪变性供肝相当的移植疗效。本研究为科学拓展脂肪变性供肝的使用提供了新思路与新策略。作者贡献声明
胡鑫豪：实验设计、数据分析、文章撰写；蓝天辰：数据收集、数据分析；陈键：数据收集；戚浙拓、陈昊：数据整理；高逢强、董立彬、阳新宇：数据分析；陈键：实验设计、研究指导；郑树森：研究指导、论文审阅；徐骁：研究指导、论文审阅、经费支持胡鑫豪,蓝天辰,陈键,等. 供肝胆管反应在肝移植疗效评价中的应用价值研究[J]. 中华器官移植杂志,2024,45(08)：550-557.DOI:10.3760/cma.j.cn421203-20231231-00208.
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