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肾移植术后供者特异性抗体针对性治疗单中心效果观察
海军军医大学第一附属医院器官移植科，上海 200433
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复旦大学附属华山医院泌尿外科肾移植学术带头人
国家肾脏移植医疗质量控制中心专家委员会委员
中国医药生物协会移植技术分会副主任委员
中华医学会器官移植学分会感染学组副组长
中华医学会器官移植学分会肾移植学组，儿童移植学组委员
中华医学会泌尿外科学分会肾移植学组委员
上海市医学会器官移植学分会病理学组组长
上海市肾脏移植质量控制中心专家委员会委员
【摘 要】目的探讨供者特异性抗体（donor specific antibodies，DSA）针对性治疗的疗效和影响因素。
方法回顾性观察分析2016年1月至2021年1月在海军军医大学第一附属医院接受肾移植手术、行DSA规律检测并发现阳性且接受以利妥昔单抗（rituximab，RTX）联合静脉注射免疫球蛋白（intravenous immune globulin，IVIG）为基础的DSA针对性治疗方案的34例受者的临床资料。分析预存DSA（preformed DSA，pfDSA）转阴率与DSA类别、治疗开始距离移植手术时间、DSA针对的HLA位点及DSA强度的相关性，治疗前后免疫显性DSA（immunodominant DSA，iDSA）水平及新生DSA（de novo DSA，dnDSA）阳性受者血肌酐水平变化情况。
结果全部34例受者中，治疗后3个月完全转阴17例（50%），末次随访时转阴19例（55.9%）。对受者体内针对所有位点的78个DSA进行统计后发现，pfDSA及dnDSA的转阴率在治疗后3个月［62.9%（39/62）比37.5%（6/16）］及末次随访时［74.2%（46/62）比56.3%（9/16）］差异均没有统计学意义（P=0.067和0.219）。对于pfDSA，治疗3个月后，不同MFI强度的pfDSA转阴率差异明显［DSA弱阳性转阴率78.6%（33/42），DSA阳性及以上转阴率30%（6/20），P<0.001］，而且是pfDSA能否转阴的独立影响因素（48.6%，95%CI：22.3%~66.8%，P=0.001）。末次随访时，不同治疗开始时间受者的pfDSA转阴率差异明显［术后30 d以内转阴率79.2%（42/53），术后30 d以上转阴率44.4%（4/9），P=0.042］，不同DSA MFI强度受者的pfDSA转阴率亦差异明显［DSA弱阳性转阴率88.1%（37/42），DSA阳性及以上转阴率45%（9/20），P<0.001］，而且两者都是pfDSA能否转阴的独立影响因素（34.8%，95%CI：3.2%~61.8%，P=0.008；43.1%，95%CI：18.5%~63.4%，P=0.001）。治疗后3个月免疫显性DSA（immunodominant DSA，iDSA）的平均荧光强度（mean fluorescence intensity ，MFI）较治疗前下降幅度的均值为66.67%，末次随访时iDSA MFI下降幅度的均值为77.90%，差异有统计学意义（P=0.035）。9例dnDSA弱阳性及以上强度受者治疗前、治疗期间、治疗后3个月及末次随访时的血肌酐值分别为（110.2±26.9）μmol/L、（178.8±90.5）μmol/L、（153.9±72.8）μmol/L及（213.6±185.8）μmol/L。治疗期间血肌酐水平较治疗前明显上升（配对样本t检验，t=–2.794，P=0.023），治疗后3个月较治疗期间明显下降（配对样本t检验，t=3.430，P=0.009），而末次随访时较治疗后3个月再次上升（秩和检验，P=0.028）。
结论接受以RTX+IVIG为基础的DSA针对性治疗后，pfDSA的转阴率与其强度及接受治疗的时间明显相关，治疗后DSA总体无明显反弹，dnDSA阳性受者的移植肾功能在治疗后短期内得到一定改善。
【关键词】 肾移植；供者特异性抗体；利妥昔单抗；静脉注射丙种球蛋白抗体介导的排斥反应（antibody mediated rejection，AMR）是导致肾移植术后移植肾失功的主要原因之一[1]。其中供者特异性抗人类白细胞抗原抗体（donor⁃specific anti⁃human leukocyte antigen antibodies，HLA⁃DSA）发挥着重要作用[2]。肾移植术后AMR是以DSA为病因的进行性疾病过程。DSA又可分为预存DSA（preformed DSA，pfDSA）和新生DSA（de novo DSA，dnDSA）。其中，pfDSA的存在提示受者体内已对供肾产生免疫记忆，移植肾功能可能在移植后短时间内受损甚至失功；而长期存在的pfDSA还会使受者发生AMR的风险明显升高，严重影响预后[3⁃4]。dnDSA阳性是受者免疫抑制不足的标志，是进行监视性活检的指征，可以帮助早期发现活动性AMR并进行治疗[5]。因此，对DSA进行规律筛查，早期发现并进行针对性治疗，可以降低AMR的发生风险或损伤程度，DSA发现的越早，处理越及时，治疗效果越好[6]。对DSA进行针对性治疗就必须考虑DSA的本身特点，国际移植学会专家共识在2019年将DSA的类别及AMR的发生时间纳入了AMR治疗的考量因素[7]。近年来，海军军医大学第一附属医院器官移植科通过参考各中心经验及指南推荐并结合中心实践发现，DSA强度越高，出现AMR的概率越大[3,8⁃9]。本中心进一步将DSA强度纳入DSA针对性治疗考量因素，设计了以抗CD20单克隆抗体⁃利妥昔单抗（rituximab，RTX）+静脉注射免疫球蛋白（intravenous immune globulin，IVIG）为基础的治疗方案，如受者DSA强度高，则再联合应用血浆置换（plasma exchange，PE）、蛋白酶体抑制剂⁃硼替佐咪（bortezomib，BTZ）等进行个体化治疗。本研究通过回顾2016年1月至2021年1月在本中心接受DSA针对性治疗受者的临床资料，初步分析了DSA类型、治疗开始距离移植手术时间、DSA针对的位点、DSA强度等与DSA治疗后转归的相关性，为各位同仁提供参考。2016年1月至2021年1月在海军军医大学第一附属医院接受肾移植手术受者。纳入规律检测外周静脉血HLA抗体，发现DSA弱阳性及以上强度并接受DSA针对性治疗且临床资料完整受者；同时排除围手术期移植肾失功（供肾原因）、移植肾带功死亡（心脑血管意外、外科因素等非DSA针对性治疗相关并发症导致死亡）、依从性差以及失访受者。综合考虑受者移植肾功能及其变化、DSA平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）、病理诊断结果、个人意愿等因素制定治疗方案。当受者的肾功能下降速度较快（48 h内血肌酐绝对值增加≥27 μmol/L或上升≥20%或尿量下降明显），或病理诊断已经明确为急性AMR（acute AMR，aAMR）且DSA MFI≥3 000则建议受者使用PE和（或）BTZ进行治疗；如非以上情况，临床无排斥表现或肾功能已经进入终末期（血肌酐≥443 μmol/L），则多以安全性为首先考虑，建议受者使用IVIG和（或）RTX。具体治疗方案见图1。![]()
图1 供者特异性抗体针对性治疗方案注：横坐标为治疗天数；DSA为供者特异性抗体；RTX为利妥昔单抗；PE为血浆置换；BTZ为硼替佐米；IVIG为静脉注射免疫球蛋白
通过查阅病案、门诊随访、电话随访等方式收集受者性别、移植时年龄、既往是否有异体移植病史、是否为活体供肾、围手术期免疫诱导治疗方案、供受者HLA高分辨基因分型、随访时间以及受者HLA抗体规律检测资料。其中，Ⅰ类DSA指针对Ⅰ类HLA位点的DSA；Ⅱ类DSA指针对Ⅱ类HLA位点的DSA。免疫显性DSA（immunodominant DSA，iDSA）指同一受者体内的DSA中，强度最高也被认为是起主要作用的DSA。采用美国One Lambda公司的抗体检测产品LAB Screen对受者的静脉促凝血进行HLA抗体检测。首先进行初筛试验，初筛阳性者应用单抗原微珠（single antigen beads,SAB）方法进行确定试验。应用One Lambda公司的LABType XR SSO产品，采用特异性寡核苷酸探针法进行HLA分型[10]。肾移植受者手术当日采血送检HLA抗体，同时供者抗凝血送检HLA高分分型。3~7 d后结果回报，比对分析判定pf DSA。pf DSA弱阳性及以上强度受者治疗后3个月行HLA抗体检测，如未转阴则每3个月检测1次，转阴则每6个月检测1次。DSA阴性受者术后3、6、12个月检测，如均为阴性则后续每年检查1次即可。如出现dnDSA则建议行DSA针对性治疗，治疗后3个月行HLA抗体检测，如未转阴则每6个月检测1次，转阴则每年检测1次。比对受者的SAB HLA抗体检测报告和供者的HLA高分辨基因分型资料，如供者HLA与受者抗体针对位点一致则判定为DSA。DSA MFI在500~3 000（含500不含3 000）判定为弱阳性，在3 000~10 000（含3 000不含10 000）为阳性，≥10 000为强阳性[11]。如有阳性抗体，且供者抗原型别未被抗体检测试剂包含，则通过公共抗原表位分析判别抗体是否为DSA[12]。应用Excel 2016进行资料收集和数据整理，应用SPSS 24.0软件进行统计学处理。计数资料用百分比表示，计量资料用均值±标准差表示。计数资料单因素分析采用Pearson χ2检验或Fisher精确检验，P<0.2纳入多因素logistic回归分析；计量资料对比首先进行正态检验，符合正态分布者采用配对样本t检验，不符合正态分布者采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。最终本次研究共纳入34例受者，移植时年龄（42.12±10.23）岁，男性占比50.0%（17/34），活体供肾4例（11.8%），32例（94.1%）采用兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白进行免疫诱导，30例（88.2%）为首次移植，移植术后随访时间为（63.35±12.54）个月，接受DSA针对性治疗后随访时间为（54.50±18.23）个月，pf DSA阳性25例（73.5%）。34例受者中，接受RTX+IVIG治疗19例，接受RTX+IVIG+BTZ治疗5例，接受RTX+IVIG+PE治疗6例，接受RTX+IVIG+BTZ+PE治疗4例。本研究中有5例受者接受治疗后DSA无明显变化，其中pfDSA弱阳性及以上强度受者4例，dnDSA弱阳性及以上强度受者1例，长期随访血肌酐均保持稳定；有2例（pfDSA阳性1例，dnDSA阳性1例）在接受治疗后DSA位点减少，且DSA MFI下降，但仍出现移植肾功能持续下降直至失功。治疗后出现感染2例，pfDSA阳性受者1例，术后1年余接受BTZ+RTX+IVIG方案治疗，治疗后1月余出现颜面部皮肤感染；dnDSA阳性受者1例，术后1年余接受PE+BTZ+RTX+IVIG方案治疗，用药结束后即发现严重肺部感染，经治疗后最终全部治愈。余受者未出现感染等副作用。治疗后3个月时，34例DSA弱阳性及以上强度受者完全转阴17例（50.0%），末次随访时完全转阴受者19例（55.9%）。15例未转阴的受者中，12例含有针对HLA⁃DQ位点的DSA。对34例受者体内所有78个DSA进行统计，治疗后3个月时pfDSA和dnDSA转阴率分别为62.9%（39/62）和37.5%（6/16），末次随访时pfDSA和dnDSA转阴率分别为74.2%（46/62）和56.3%（9/16），不同时间点转阴率比较，差异均没有统计学意义（P=0.067和0.219）。单因素分析结果显示，治疗3个月后不同MFI强度的pfDSA转阴率差异明显[DSA弱阳性转阴率为78.6%（33/42），DSA阳性及以上强度转阴率为30.0%（6/20），P<0.001]，而治疗开始距离移植手术时间在30 d内的pfDSA转阴率与在30 d以上的pfDSA转阴率[66.0%（35/53）比44.4%（4/9）]差异没有统计学意义（P=0.272），经治疗后Ⅰ类DSA转阴率与Ⅱ类DSA转阴率[78.9%（15/19）比55.8%（24/43）]差异亦无统计学意义（P=0.082）。（表1）表1 治疗后不同时间点pf DSA转阴情况与治疗开始时间、DSA位点与强度分析［个（%）］
注：DSA为供者特异性抗体；HLA为人类白细胞抗原；MFI为平均荧光强度
末次随访时，治疗开始时间在术后30 d以内的pfDSA转阴率与术后30 d后的pfDSA转阴率[79.2%（42/53）比44.4%（4/9）]差异明显（P=0.042），不同MFI强度的pfDSA转阴率差异明显[DSA弱阳性转阴率88.1%（37/42），DSA阳性及以上强度转阴率45%（9/20），P<0.001]，但Ⅰ类DSA与Ⅱ类DSA经治疗后转阴率[84.2%（16/19）比69.8%（30/43）]没有明显差异（P=0.347）。（表1）多因素logistic回归分析结果显示，治疗3个月后DSA强度是pfDSA转阴的独立影响因素（48.6%，95%CI：22.3%~66.8%，P=0.001），末次随访时治疗开始时间及DSA强度都是pfDSA转阴的独立影响因素（34.8%，95%CI：3.2%~61.8%，P=0.008；43.1%，95%CI：18.5%~63.4%，P=0.001）。16个dnDSA中，4个针对Ⅰ类HLA的dnDSA，治疗3个月后全部转阴；12个针对Ⅱ类HLA的dnDSA，治疗3个月后转阴2个，末次随访时转阴5个。MFI强度为弱阳性的有9个，治疗3个月后转阴6个，末次随访时为7个，阳性及以上治疗3个月后无转阴，末次随访时发现转阴2个。由于总例数不足，未进行率的计算和统计学分析。34例受者治疗前、治疗后3个月和末次随访时的iDSA MFI值分别为7 848.4±8 146.8、3 084.4±5 421.1和2 590.9±5 162.6。治疗后3个月iDSA MFI较治疗前下降幅度[（治疗后iDSA MFI⁃治疗前iDSA MFI）/治疗前DSA MFI×100%]的均值为66.67%，末次随访时iDSA下降幅度的均值为77.90%，两者差异有统计学意义（P=0.035）。25例pfDSA弱阳性及以上强度受者中，13例于术前接受治疗，9例于术后1周左右开始治疗，3例开始治疗时间距离移植时间超过30 d，由于接受治疗的时间存在差异，且多为预防性治疗，因此未进行统计学计算。9例dnDSA弱阳性及以上强度受者治疗前、治疗期间、治疗后3个月及末次随访时的血肌酐值分别为（110.2±26.9）μmol/L、（178.8±90.5）μmol/L、（153.9±72.8）μmol/L及（213.6±185.8）μmol/L。不同时间点比较结果显示，治疗时受者血肌酐较治疗前明显上升（配对样本t检验，t=–2.794，P=0.023），治疗后3个月较治疗时明显下降（配对样本t检验，t=3.430，P=0.009），而末次随访时较治疗后3个月再次上升（秩和检验，P=0.028）。（图2）![]()
图2 新生DSA阳性受者治疗前后血肌酐对比注：*为P<0.05；ns为P>0.05；dnDSA为新生DSA
DSA的针对性治疗主要包括清除循环DSA和减少DSA产生2个方面。目前治疗方法较多，如清除循环DSA的PE[13]、抑制DSA生成的IVIG[14]、抗CD20单克隆抗体⁃RTX[15⁃16]、蛋白酶体抑制剂⁃BTZ[17]等。治疗方法虽多，但费用和风险不一，且根据受者的临床实际，在现实中难以对每位受者采取完全一致的治疗方案。2022年国内专家针对肾移植AMR的诊治撰写了一组系列共识，其中对于致敏等待者的脱敏治疗，认为尚无定法，建议在受者充分知情后谨慎选择并制定个体化治疗方案，一般以清除血浆抗体为基础，联合IVIG或RTX等治疗[18]。对于移植后期AMR则认为慢性活动性AMR（chronic active AMR，caAMR）[5]是后期AMR的主要病理表现类型，建议对DSA进行针对性治疗，推荐将血浆置换和IVIG作为标准基础治疗[11]。以PE+IVIG为基础的治疗方案，可快速清除循环DSA，因此一直被视为AMR的标准治疗方案[7,19]。但PE需建立大血管通路，输注大量血浆，创伤大、花费高，血浆资源相对稀缺，有时难以足量获得，血浆输注又可能使大量的异体抗原进入体内，有致敏的潜在风险，治疗后DSA有反弹的可能[7]；且在规律性监测DSA的前提下，相当一部分DSA在发现时尚处于弱阳性水平，对其进行PE治疗，有待商榷。IVIG不但具有抑制抗体生成的作用，还能促进抗体清除；RTX的B淋巴细胞清除作用则可使生成抗体的浆细胞的前体细胞进一步减少，从而达到促进DSA转阴的目的。Charnaya等[20]对26例肾移植dnDSA阳性的儿童受者采取了个体化治疗措施：当dnDSA MFI在1 000~2 000、C1q（–）、C4d（–），仅应用IVIG；当dnDSA MFI>2 000、C1q（+）、C4d（–），则应用IVIG+2剂RTX（每剂750 mg/m2）的治疗方案；当dnDSA MFI>2 000、C1q（±）、C4d（+），应用IVIG+RTX+PE的治疗方案；如受者对以上治疗抵抗，则连续4个月应用IVIG，并调整免疫抑制维持治疗方案；采取上述治疗方案后，dnDSA总体转阴率为46.15%，且移植肾功能维持稳定，长期预后与DSA阴性患儿相同。这一结果与本研究55.88%（19/34）的转阴率类似。需要强调的一点是，DSA针对性治疗的持续疗效有赖于免疫抑制维持治疗的优化和加强。本研究受者使用的CNI以他克莫司为主，浓度维持在相应治疗窗的上限，抗增殖类药物也根据淋巴细胞数量维持在相对高剂量。这也许就是DSA转阴率由治疗后3个月的50%逐渐上升的原因。在治疗的过程中，短期计划性的连续活检可以阶段性的动态观察治疗疗效及转归，但因其花费高、创伤大、并发症相对较多等原因在临床难以实现，DSA虽然只有疾病诊断的预测价值[21⁃22]，尚无法取代移植肾活检，但作为一项非侵入性标志物及AMR的主要致病因素，在治疗过程中对其进行连续监测可以在一定程度上反应AMR的严重程度[23⁃24]。Viglietti等[25]对278例经活检证实为AMR的肾移植受者进行研究发现，在治疗前，DSA MFI可以预测受者预后；在治疗后，DSA MFI的变化可以评估治疗是否有效。因此，对DSA进行规律监测是DSA针对性治疗的重要内容，其中移植术前及围手术期的监测往往被忽视。由于等待移植时间长，移植等待者在登记时进行的HLA抗体检测结果常常无法代表手术时的免疫状态。本组25例pfDSA中，有12例是在手术当天的检测中发现的，这也正是本研究组推荐所有受者在移植当天和手术前留取血样复查HLA抗体的原因。DSA的自身特点如治疗开始的时间、强度、针对的位点等对治疗的反应性都有不同的影响。本研究治疗3个月后pfDSA与dnDSA的转阴率分别为62.9%（39/62）和37.5%（6/16），差异较大但无统计学意义（P=0.067）；到末次随访时pfDSA与dnDSA的转阴率分别74.2%（46/62）和56.3%（9/16），差异明显缩小，这可能都与DSA出现后免疫抑制维持治疗较强有关。DSA针对的位点不同，抗体与抗原的结合度等也有所不同，治疗3个月后，针对Ⅰ类HLA和针对Ⅱ类HLA的pfDSA的转阴率分别为78.9%（15/19）和55.8%（24/43），差异较大但无统计学意义（P=0.082）。Redondo⁃Pachón等[26]发现，体内出现pf DSA的移植受者中，Ⅱ类pf DSA明显多于Ⅰ类DSA。Kincaide等[27]对13例接受PE+IVIG+RTX方案治疗的AMR儿童受者体内的68个DSA进行观察分析后发现，治疗后30 d时Ⅰ类DSA的治疗反应性更好。本中心前期研究发现针对HLA⁃DQ位点的DSA是肾移植受者dn DSA的主要组成[28]。还有研究发现术后持续存在的pfDSA，针对HLA⁃DQ位点的比例较高，且治疗反应性较差[3,29]。而开始治疗与移植手术间隔时间较短受者末次随访时pfDSA的转阴率较高[79.2%（42/53）比44.4%（4/9）]，这提示对于DSA要进行规律监测，早发现早治疗可明显提高DSA转阴率。本研究根据DSA MFI是否大于3 000对DSA的强度进行了分类分析，发现pfDSA的强度无论在治疗后3个月还是在末次随访时都与其转归具有独立相关性。Redondo⁃Pachón等[30]对39例pf DSA阳性受者进行分析，计算出iDSA是否转阴的界值为5 100（AUC=0.803，P=0.002）。本研究由于样本量小，未计算iDSA转阴的界值。本研究具有和以往类似研究共同的局限性：首先设置空白对照难，当DSA阳性受者出现移植肾功能下降时，必须对其进行治疗；其次获得DSA的规律检测数据难，DSA的重要作用尚未在移植受者中得到普遍认识，对DSA检测的依从性差，这也是导致本研究样本量小的主要原因，因此结论需要进一步验证。AMR对移植肾功能的损害已被业界普遍认同，但其诊断和治疗仍困难重重。本研究通过对在上海长海医院接受肾移植手术的34例受者进行回顾性观察，统计分析其体内共78个DSA的转归及其相关因素，发现对于pfDSA，DSA强度与其转阴率独立相关，而治疗时间在治疗后3个月内与转阴率未呈现相关性，但随着随访时间的延长，其亦成为独立相关因素。对iDSA的统计分析提示，治疗后DSA MFI总体未见明显反弹。受者的移植肾功能一直是我们关注的重点，本研究中的9例dnDSA阳性受者在治疗后短期内总体上有所好转，但长期随访下仍呈上升趋势。本研究存在诸多不尽如人意之处，我们将继续完善，希望能为各位同道提供有价值的参考，为DSA治疗略尽绵薄之力。作者贡献声明
朱晓隆、付嘉钊、陆瀚澜、赵闻雨、隋明星、曾力、朱有华、张雷：酝酿和设计实验、实施研究；朱晓隆、隋明星：数据整理、统计学分析；朱晓隆、隋明星：文章撰写；张雷：研究指导、论文修改、经费支持。朱晓隆,付嘉钊,陆瀚澜,等. 肾移植术后供者特异性抗体针对性治疗单中心效果观察[J]. 中华器官移植杂志,2024,45(9):628-635.DOI:10.3760/cma.j.cn421203-20230829-00065.
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