肺再生中不同细胞的角色
1. 浙江大学医学院附属第二医院肺移植科，杭州 310000；2. 浙江大学医学院附属第二医院综合ICU 多脏器衰竭预警与干预教育部重点实验室，杭州 310000
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浙江大学博士生导师、南京医科大学二级教授、博士生导师
浙大二院副院长、肺移植中心主任、南医大附属无锡市人民医院、江苏省肺移植中心主任、
中国人体器官捐献与移植委员会委员
中华器官移植学会常务委员，肺移植组组长
国家卫健委肺移植数据管理单位负责人、
国家肺移植质控中心主任
国务院特殊津贴获得者
国家卫计委突出贡献中青年专家
三届全国人大代表
【摘 要】 未受侵扰的肺高度静止，细胞更新水平低。然而，肺在受损后显示出广泛的再生能力，常驻祖细胞群重新进入细胞周期并分化以促进修复。由于肺组织结构及细胞组成的复杂性，位于不同区域的肺细胞表现出不同的再生策略。因此，深入了解不同类型细胞在损伤，修复和再生中的相互作用有助于全面认识肺再生的发生过程。本文针对肺损伤后参与再生的不同类型的细胞的作用及机制进行综述，以启发临床医师依据不同细胞的再生特性探索出新的肺再生干预手段为治疗各种呼吸系统疾病提供新思路。【关键词】 再生；Ⅱ型肺泡上皮细胞；内皮细胞；免疫细胞作为与外界相通的脏器，肺容易受到病毒、细菌等病原体和各种理化因素的影响，导致呼吸道上皮和血管系统遭受急性或慢性损伤。最近研究表明，肺在受到损伤后具有一定的再生和修复能力[1⁃2]。在这一过程中，肺内的多种祖细胞和干细胞被唤醒以补充受损的细胞，促进肺的再生。生理状态下，肺部的气体交换是由多种不同类型的细胞协同完成的。肺泡作为肺的基本功能单元，其壁由单层肺泡上皮细胞和基膜构成。肺泡上皮细胞主要由Ⅰ型肺泡上皮细胞（alveolar epithelial typeⅠcell，AT1)和Ⅱ型肺泡上皮细胞（alveolar epithelial typeⅡcell，AT2）组成。AT1细胞和AT2细胞分别负责气体交换及肺泡结构稳定与损伤后修复[3⁃4]。此外，基底细胞、棒状细胞及巨噬细胞参与维持肺结构及功能稳定。针对损伤的不同细胞类型进行靶向干预可能是减轻肺损伤，促进肺修复与再生的有效手段。本文针对肺损伤后参与再生的不同类型的细胞的作用及机制进行概述。肺结构复杂，细胞构成种类繁多。当肺受伤时，炎症反应被激活，炎症细胞产生的细胞因子和趋化因子激活常驻肺细胞，启动其去分化并进入细胞周期[3]。炎症反应的时机和程度至关重要，持续而激烈的炎症反应可能导致修复再生不当[4]。当炎症反应逐渐减弱后，再生信号通路介导肺结构的重建。在啮齿类动物的肺叶切除模型及纤维化模型中已经观察到肺叶再生和肺功能恢复，但有关于成人肺再生的数据仍有待积累。Chen等[1]在1例50岁新型冠状病毒感染（COVID⁃19）患者的肺中观察到，具有干细胞特征的AT2大量聚集在肺泡上皮处，通过透射电镜观察到AT2向AT1分化的中间态细胞标志物，表明AT2可通过分化成AT1样细胞来参与肺泡再生，且分化过程发生在病毒感染致使肺损伤之后。此外，一项病例报告指出，1例切除右侧肺叶的患者在术后15年内，左肺体积逐渐增大，组织密度增加[2]。因此，尽管肺在成熟时基本处于静止状态，但在受损后表现出显著的再生能力，具有不同分化能力的多能干细胞可能在肺再生过程中发挥重要作用。受损肺上皮细胞的修复主要由气管和传导气道的基底细胞和棒状细胞以及肺泡区域的AT2介导。基底细胞在出生后发育和成年后损伤修复模型中均作为多能祖细胞发挥作用，它们可以自我更新并分化为纤毛细胞和棒状细胞。此外，棒状细胞可在细支气管损伤后产生新的纤毛细胞。在肺泡中，AT2作为兼性祖细胞，在成人肺损伤后既可迅速增殖又可分化为AT1以再生肺泡。动物试验中，出生后的小鼠AT2可以通过表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）⁃Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog，KRAS）信号介导的体内自我更新，并在衰老或高氧损伤后产生AT1[5]。类器官培养实验表明，单个谱系标记的AT2可产生肺泡样结构，该结构中包含AT2细胞和表达AT1标志物的细胞[6]。另一项研究表明，AT1和AT2来源于胚胎肺发育过程中的双能祖细胞，而新分化的AT1则来源于出生后的一小部分成熟AT2，当AT1受伤时，AT2的再生能力可被广泛激活[5]。机械张力在维持正常肺泡结构中扮演着关键角色[7]，通过激活c⁃Jun氨基端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路促使转录因子YAP进入核，从而调控AT2细胞的基因表达，促使肺泡的重塑[8]。AT2细胞再生通常还涉及Hippo、Notch1、Wnt等信号通路[9⁃11]。此外，claudin蛋白家族的成员CLDN18通过调节YAP活性来限制AT2的过度增殖，从而避免AT2过度增殖[12]。尽管AT2成为出生后肺泡再生主要细胞类型，但由于损伤和组织修复的异质性，调节AT2行为的细胞和分子过程知之甚少。目前关于肺泡上皮再生多聚焦于AT2的可塑性上，然而，近期的研究表明AT1可能具有比既往认知更为广泛的功能。Penkala等[13]的研究发现AT1在新生儿和成人急性肺损伤后都表现出强大的重新编码成AT2的能力，从而补充AT2的细胞库，且这种可塑性保留在成人肺中。AT1的可塑性使肺泡更加灵活地应对损伤。然而，出乎意料的是，在出生后早期肺泡生成期间，AT2在急性肺损伤后并不能有效地再生AT1。因此需要更多的研究来确定AT1与AT2在不同损伤和疾病状态下相互重编码的具体机制。据报道，棒状细胞和AT2可由共表达scgb1a1和sftpc的支气管肺泡干细胞（bronchoalveolar stem cell，BASC）补充，这些细胞可在体外分化为细支气管和肺泡[14]。Liu等[15]利用命运图谱和克隆分析技术发现，BASC在肺稳态期间相对稳定，在不同肺损伤类型中被激活。BASC在萘处理的小鼠细支气管损伤后产生棒状细胞和纤毛细胞，并在博来霉素诱导的肺泡损伤模型中促进AT1和AT2生成。因此，BASC是在肺修复和再生过程中具有多能性和自我更新能力的肺上皮干细胞。血管生成对于形成功能性肺泡至关重要，内皮细胞在新生儿和成人肺损伤后表现出显著的再生潜力。谱系追踪技术表明，小鼠中的心肺中胚层祖细胞产生构成肺脉管系统的大部分谱系，包括平滑肌和毛细血管内皮（capillary endothelial cell，PCEC）[16]。在靶向消融小鼠的肺内皮细胞后，单细胞测序鉴定出除常规表达apelin受体的PCEC外，于第3天鉴定出新出现的表达干细胞标记物蛋白C受体的PCEC。这种干细胞样细胞在第5天时转变为增殖性内皮祖细胞样细胞，表达apelin受体和促增殖转录因子FOXM1，并在损伤后7 d快速补充所有耗尽的内皮细胞群体[17]。FOXM1是内皮再生研究较为深入的转录因子，遗传谱系追踪研究表明，脓毒症诱导的肺血管损伤后的内皮再生是由成年小鼠的肺常驻内皮细胞增殖介导的，FOXM1是成年小鼠内皮再生的重要介质，而这种再生程序在老年小鼠中受损。转基因FOXM1过表达或靶向内皮纳米颗粒递送FOXM1基因激活内皮再生的信号通路，可促进血管修复和炎症消退[18]。此外，Niethamer等[19]的研究发现转录因子ATF3对于流感感染后小鼠肺内皮的再生反应至关重要。ATF3的缺失导致小鼠的肺内皮细胞凋亡增加、增殖减少和内皮细胞的持续性丢失，进而导致组织修复过程中肺泡结构畸形。未来，进一步剖析受损内皮再生和血管修复机制，阐明肺组织的特异性调节，阐明外源祖细胞释放的多种细胞因子对内皮细胞再生的影响，有助于开发促进内皮再生和血管修复的新方法。值得注意的是，其他类型细胞如成纤维细胞是否可以在损伤部位直接转化为内皮祖细胞甚至内皮细胞以进行原位内皮再生仍具有较大研究潜力。肺的再生和修复需要肺泡成纤维细胞（pulmonary alveolar fibroblast，PAF）来调控肺上皮细胞的行为。一方面，PAF可以提供和调节细胞外基质支架，供上皮细胞扩增。另一方面，PAF还可以旁分泌形式促进周围上皮细胞和内皮细胞的增殖和分化。发育过程中，PAF可被定义为四个功能群体：肌成纤维细胞、脂质成纤维细胞、基质成纤维细胞和肺泡生态位细胞[20]。在小鼠左肺叶切除模型（left unilateral pneumonectomy，PNX）中，PAF的再生过程被激活，表明PAF的功能一直持续到成年时期。肌成纤维细胞产生骨形态发生蛋白bmp4，与WNT信号通路对抗并调节AT2更新、分化和再生[21]。脂质成纤维细胞在脂肪分化相关蛋白adrp的帮助下将中性脂质转移到AT2中，用于表面活性剂磷脂合成并支持AT2增殖和分化为新的AT1[22]。肺泡生态位细胞产生WNT配体，其主要通过WNT信号传导在发育和修复过程中补充上皮祖细胞池。尽管单细胞测序技术的出现大大增加对PAF异质性的理解，但同时也增加了对PAF命名、分群和分期的混淆。未来需要进一步探索PAF在肺再生中的作用机制。免疫系统介导组织愈合的过程纷繁复杂，但高度协调。驻留的肺泡巨噬细胞（tissue⁃resident alveolar macrophages，TR⁃AM）以及肺间质巨噬细胞（interstitial macrophages，IM）肺的先天性免疫应答。在炎症反应消退期，TR⁃AM逐渐转化为抗炎表型，促进炎症过程中病原体和碎片的清除[23]。研究表明，肺损伤后巨噬细胞通过表达蛋白tff2修复因子，促进WNT基因上调从而加速上皮屏障恢复。此外，TR⁃AM在肺损伤后数量增加，上调血管生长基因的表达，促进肺泡毛细血管的生成[24]。除TR⁃AM自我增殖外，在另一项研究中发现，来源于循环中的单核细胞在肺损伤过程中可被招募至肺泡并分化为巨噬细胞，并促进上皮细胞增殖，这提示循环来源的单核巨噬细胞可能是肺再生的另一亚群。IM在损伤修复中也发挥重要作用。利用单细胞测序发现肺损伤后第7天，IM的数量和更新频率显著增加，而TR⁃AM的数量和更新频率减少。此外，IM衍生的白细胞介素1β激活了AT2亚群，后者可进一步分化为AT1和AT2[25]。调节性T淋巴细胞（regulatory T cell，Treg）已被证明可通过调节先天性和适应性免疫来促进组织修复和再生。在急性肺损伤模型中，白喉毒素处理特异性消除小鼠的Treg后，肺修复期间的上皮增殖受损。损伤后肺上皮细胞增殖与Treg数量密切相关，Treg通过其表面整合素CD103与上皮细胞表达的E⁃钙黏着蛋白结合促进AT2增殖[26]。细胞因子是一种由细胞分泌的，具有调控生物体免疫、炎症、增殖、分化等生理功能的生物活性分子。成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）是一大类主要由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞表达的分泌因子，通过酪氨酸激酶受体发挥作用[27]。在早期发育期间，FGF10以剂量依赖的方式刺激肺泡上皮细胞谱系的形成。β连环蛋白是位于FGF信号下游的蛋白，暴露于博莱霉素的小鼠肺上皮显示β连环蛋白信号的特异性缺失，导致纤维化增加[28]。过表达FGF10的博莱霉素损伤小鼠显示出更高的存活率，以及肺纤维化更迅速地消退[29]。虽然FGF表现出明显的保护作用，但值得注意的是，针对特发性肺纤维化酪氨酸激酶的既定疗法（如尼达尼布）也会抑制FGF信号传导，这可能导致负面作用。因此，迫切需要确定内源性FGF信号在肺损伤修复中的作用。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）14是上皮细胞扩增以及肺泡结构和肺功能恢复所必需的。在发育中的小鼠胎肺中，MMP14可通过刺激上皮增殖和迁移调节肺泡形成[30]。在PNX模型中，尽管MMP14特异性敲除未干扰血管内皮增殖，但影响了肺泡再生，这表明MMP14在诱导再生肺泡形成中起着关键作用。在PNX的早期阶段，血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）2的激活很大程度上诱导了BASC的扩增，VEGFR2还与成纤维细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）协同作用，通过促进 MMP14 的表达，维持功能性肺泡⁃毛细血管单位的再生[31⁃32]。在面对慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化等慢性肺部疾病时，传统治疗方法的局限性推动了对更有效的治疗策略的探索。细胞疗法，特别是基于干细胞和细胞外囊泡的干预手段，为肺部修复和再生提供了新的可能性。间充质干细胞是多能细胞，具有分化成多种细胞类型的能力。Ortiz等[33]首次报道，博莱霉素滴注后立即经颈静脉注入的骨髓间充质细胞能够迁移到肺损伤部位，减少炎症和胶原沉积。研究表明，间充质干细胞可以作为抗原呈递细胞，通过蛋白桥转移线粒体和其它胞质成分[34]。间充质干细胞还可以通过刺激支气管肺发育不良小鼠模型中的内源性肺特异性干细胞（如BASC）来促进肺修复[35]。此外，使用细胞外囊泡已被提议作为细胞注射方法的潜在替代方案。人支气管和气道上皮细胞来源的细胞外囊泡内包含微小RNA（miRNA），通过抑制经典和非经典WNT信号通路可以抑制转化生长因子（transforming growth factor，TGF）⁃β诱导的肌成纤维细胞分化和肺上皮细胞衰老[36]。此外，从健康孕妇的脐带血中分离出的人类内皮祖细胞，其衍生的细胞外囊泡可将miRNA⁃126递送至受损的上皮细胞中，从而缓解脂多糖诱导的急性肺损伤[37]。总之，由于肺实质细胞长时间静止，了解成人肺中细胞如何更新和调节十分具有挑战性。在急性损伤阶段，肺内多种细胞参与损伤后修复与再生，成纤维细胞增殖并形成细胞外基质，为AT2增殖分化提供支架，血管内皮细胞的再生促进AT1形成功能性肺泡结构，免疫细胞及各种细胞因子共同协调再生过程。事实上，肺内有许多不同的细胞类型，从气管到肺泡间隙，单细胞测序至少已经描述了40种不同的细胞谱系，肺的内在复杂性为寻找并筛选出真正的干细胞或祖细胞增加难度。因此，严格定义各种细胞类型的作用以及精确的信号通路对肺损伤后修复和再生中的影响将是未来研究的新兴方向。此外，基于细胞疗法的肺再生策略已得到广泛关注，有望成为治疗呼吸系统疾病的新方法。利益冲突声明
陈静瑜,朱港归,黄曼. 肺再生中不同细胞的角色[J]. 中华器官移植杂志,2024,45(8)：532-536.DOI:10.3760/cma.j.cn421203-20231223-00201.
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