《肿瘤免疫12讲》是我们制作的第一套系列课程，主要参考《癌生物学》。建议所有肿瘤相关专业的小伙伴认真学习，最好买本纸质书。非肿瘤专业的小伙伴不做要求（我们会在以后的纯生信和R语言课程里不断学习）。我们按肿瘤免疫→纯生信→芯片数据、二代测序数据→单细胞、多组学数据处理的思路，推出了肿瘤免疫12讲、纯生信21天、R 语言21天和单细胞21天等系列教程。首先，无论是否肿瘤专业，在开启肿瘤免疫12讲学习时，务必下载《癌生物学》电子书；链接：
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对于肿瘤及相关专业的小伙伴，无论是临床、基础还是生信专业，建议购买纸质版（虽然有点厚），方便查阅；然后，按照讲义目录，结合推文、视频和资料，从肿瘤本质、肿瘤微环境等，一步一步，完成主要内容的学习；最后，按照《癌生物学》的目录，有顺序地阅读这本书；并结合平时遇到的关键词或热点，经常翻阅各个章节。![]()
1. 肿瘤的本质（疾病的本质）
作为医生，面对患者的首要反应通常是，有哪些症状和体征，需要哪些检查和检验以做出诊断，如何治疗。这是医生的条件反射，也是临床思维的重点——疾病。但是科研的内核不是疾病，而是表型。因此，临床看疾病，科研看表型！疾病是基础，是科研问题的来处；疾病是多维度的，而不同的维度由各种各样的表型来体现。CancerSEA数据库归纳了肿瘤14大常见表型：血管生成，凋亡，细胞周期，分化，DNA损伤，DNA修复，EMT表皮间质转化，缺氧，炎症，侵袭，转移，增殖，静息和干性。如铁死亡，铜死亡和衰老等也都是表型。在本节学习中，我们要学会用表型来定义疾病的思维方法！建议：果友们在学习过程中，务必学会用表型的眼光看待肿瘤和非肿瘤疾病，这种思路对于生信论文和基础科研都非常有用。而表型又可以转换为基因集，拓宽了我们认识疾病的维度！2. 肿瘤微环境
肿瘤免疫，主角自然有两个，一个是肿瘤，另一个是免疫。免疫细胞是肿瘤微环境的主要成分之一。但是肿瘤微环境又不是孤立的，它可以看作是一种免疫组织，是外周免疫的一部分。因此，肿瘤免疫与外周免疫有着千丝万缕的关系。外周免疫是认识肿瘤免疫的基础，尽管肿瘤免疫有其自身特点。此外，免疫在很多非肿瘤疾病中也发挥重要作用，比如感染、炎症、糖尿病、动脉粥样硬化和自身免疫病等。在非肿瘤疾病中，也存在类似于“肿瘤微环境”这样的概念，也存在微环境与外周免疫之间关系的情况。在本节学习中，我们主要掌握肿瘤微环境的组成、特征和肿瘤异质性概念的演进。必读：《癌生物学》第15章的全部内容（粗略阅读）； 肿瘤免疫12讲02.肿瘤微环境，从科研的角度谈谈_哔哩哔哩_bilibili
建议：在单细胞、多组学时代，我们的认知要达到单细胞分辨率层面，无论有没有掌握单细胞数据技能，思维一定要有。3. 癌基因与抑癌基因
第三部分，重点分享肿瘤通识（生化）——癌基因/抑癌基因和信号通路。正常情况下，细胞生长由两大类基因调控：正调节信号，促进增殖，抑制分化，原癌基因；负调节信号，抑制增殖，最终凋亡，抑癌基因。在19世纪70年以前，人们倾向于认为所有肿瘤均来源于病毒感染，但是由于大多数人类肿瘤中均无法找到肿瘤病毒，研究人员总结出一个理论以解释所有肿瘤的发生：致癌因子诱导正常的生长控制基因突变而形成癌基因。换句话说，癌基因是基因组内正常存在的基因，其编码产物通常作为正调控信号，促进细胞的增殖和生长。癌基因突变或表达异常才会导致肿瘤发生。癌基因活化有4种方式：- 获得强启动子或增强子。逆转录病毒基因中的启动子或增强子感染细胞时随机整合到宿主细胞的基因组中，如正好整合到原癌基因附近或内部，则会造成该基因的过量表达，如鸡肉瘤病毒导致乳腺癌。
- 基因扩增。基因扩增致编码产物过量表达，使细胞发生转化，如神经母细胞瘤中N-Myc；30％乳腺癌中 HER-2 基因发生扩增或过度表达，其表达水平与治疗后复发率和不良预后显著相关。
- 点突变。原癌基因在射线或化学致癌剂作用下，可发生点突变，改变表达蛋白的氨基酸组成，造成蛋白质结构变异，如KRAS点突变，使得MAPK通路持续激活；60％黑素瘤中 BRAF 发生突变。
- 染色体易位。染色体易位导致基因重排，使原来无活性的原癌基因转位至强启动子或增强子附近而被活化，原癌基因表达增强，导致肿瘤发生，如慢性白血病中的BCR-ABL融合表达，见于95％慢性粒细胞白血病患者。
抑癌基因是一类存在于正常细胞、抑制细胞生长的基因。抑癌基因在细胞生长、增殖及分化过程中起负调控作用。当这类基因发生突变、缺失或失活时，可以引起细胞恶性转化而导致肿瘤。抑癌基因是隐性基因。
细胞融合实验显示，非病毒导致肿瘤细胞与正常细胞融合时，杂合细胞是非致瘤性的（肿瘤表型为隐性）；而病毒来源肿瘤细胞与正常细胞融合时，杂合细胞是致瘤性的。
两次独立的遗传改变发生在同一对等位基因上，是一个极其漫长而且繁杂的过程，在短暂时间内发生这样的遗传学改变几乎是不可能的。
单个等位基因突变失活的概率是10^-6/细胞代，而等位基因两个拷贝同时发生失活的概率更是低至10^-12/细胞代。
再考虑到最初肿瘤细胞数较少，肿瘤形成需要多个遗传改变，这些突变细胞需要在几十年后才能扩增成临床可见的肿瘤。
- 除了基因突变和杂合性缺失，启动子DNA甲基化是抑癌基因失活的一种重要机制。DNA甲基化关闭抑癌基因活性。
视网膜细胞瘤基因（Retinoblastoma gene，Rb）是世界上第一个被克隆和完成全序列测定的抑癌基因。Rb基因转录产物约4.7kb，产物为928个氨基酸组成的蛋白，分子量约105kDa，称为P105-Rb。Rb蛋白分布于细胞核内，是一类DNA结合蛋白，有调节基因转录的功能。p105有磷酸化和去磷酸化两种状态，磷酸化是非活性状态，去磷酸化是活性状态。脱磷酸p105抑制细胞增殖的机理是由于它能和转录因子E2F结合。E2F能激活与DNA复制有关的酶的基因转录。当脱磷酸的p105与E2F结合后，使E2F丧失活性。在细胞G1期，Rb蛋白在被Cyclin-CDK（CyclinD/CDK4 or CyclinE/CDK2）磷酸化后变成p-Rb，然后才可以释放结合在其上的E2F，E2F是转录因子，促进S期所必需的Cyclin（细胞周期蛋白）、CDK蛋白的转录，细胞才能从G1期进入S期 。Rb基因失活与骨肉瘤有关，在许多散发性肿瘤，如50％～85％小细胞性肺癌、10％～30％乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌中都发现有Rb基因失活。- p53基因是著名的基因组卫士，该基因编码一种分子量为43.7kDa的蛋白，但因为蛋白中含有大量的脯氨酸，电泳速度被拖慢，其条带出现在Marker所示53kDa处，故而命名为p53。
- p53基因失活对肿瘤形成起重要作用。MDM2突变与P53突变不共存。p53是重要的抑癌基因，其野生型使癌细胞凋亡，防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。突变型p53会提高癌变。
- 自从p53基因在1979年被首次报道以来，有关研究论文在Medline上可查到20000余篇。在人类50%以上肿瘤组织中均发现了p53基因的突变，这是肿瘤中最常见的遗传学改变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。50％～60％人类各系统肿瘤中发现有 TP53 基因突变。
- p53蛋白主要分布于细胞核，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。正常p53的生物功能好似"基因卫士"，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。如有损伤，p53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，p53蛋白则引发细胞凋亡；如果TP53基因的两个拷贝都发生了突变，对细胞增殖失去控制，导致细胞癌变。p53蛋白还分布于线粒体、核仁等结构，并且与细胞骨架有相互作用关系。此外，多种病毒通过扰乱p53和Rb的功能，从而抑制细胞的凋亡。
2020年10月，西班牙巴塞罗那科学技术研究所的研究团队在Nature Reviews Cancer杂志发表题为A compendium of mutational cancer driver genes的研究论文。该团队对66种肿瘤的28076个肿瘤样本的基因组进行分析，鉴定了568个肿瘤驱动基因。这是迄今为止肿瘤驱动基因（Driver genes）最完整的全景图。肿瘤相关基因，可以分为Driver gene（驱动基因）和Passenger gene（伴随基因），驱动基因是导致肿瘤的病因，具有明确的因果关系；而伴随基因只是肿瘤发生中的偶然事件，具有相关性，但无因果关系。研究人员观察到多数基因具有特异性，并且其突变仅能触发少数几种肿瘤类型。其中，TP53、PIK3CA、KMT2C、ARID1A、KMT2D、LRP1B、PTEN、RB1、FAT4、KRAS，这10个基因每个突变都能导致20多种不同类型的肿瘤。TP53基因突变可导致的肿瘤超过50种。关于p53的生信分析和研究，仍然值得关注。视频：免疫浸润03.癌基因与抑癌基因_哔哩哔哩_bilibili
癌基因与抑癌基因阐释了肿瘤细胞形成的原因——抑癌基因失活和癌基因活化。癌基因及其前体——原癌基因的发现促使人们提出一些列问题，其中居于核心地位的问题是，癌基因到底如何通过它们所编码的蛋白扰乱细胞行为。癌蛋白如Src和Ras——癌基因src和ras的产物，可同时改变多种细胞的表型。单一种类的蛋白，是如何同时改变如此众多不同的信号调节通路的呢？癌蛋白作用机制的重要线索来源于对“正常细胞如何调节其生长及分化”的系统研究。正常细胞从其周围获得生长刺激信号，这些信号被细胞中复杂的信号环路处理并整合，而这一环路决定着细胞是否适合生成及分化。这就涉及配体、受体和通路了。细胞质膜的不对称性是指细胞质膜脂双层中各种成分（如蛋白、脂和糖等）不是均匀分布的，包括种类和数量的不均匀。膜蛋白的不对称指每种膜蛋白在膜中都有特定的排布方向，与其功能相适应，这是膜蛋白不对称性的主要因素。膜蛋白的不对称性包括外周蛋白分布的不对称以及整合蛋白内外两侧氨基酸残基数目的不对称。膜糖的不对称性：膜糖以糖蛋白或糖脂的形式存在，无论是糖蛋白还是糖脂的糖基都是位于膜的外表面。以生长因为例
细胞是否生长由整个组织及整个有机体的需要而定，并非仅出于有利于某些组分生长的目的。正因如此，活体内没有一个细胞被赋予自主权决定该细胞是否增殖或维持静息状态。这一决定需要与组织中其他细胞共同“商议”后才能做出。周围细胞可以通过促使某种特殊细胞分泌生长因子以刺激靶细胞的增殖，也可以通过释放生长抑制因子而抑制其增殖。最终，一个体细胞做出是否增殖的决定反映了周围细胞的群体意见。
从活体组织中分离出正常细胞，在培养皿中进行培养，可以充分说明个体细胞对环境的依赖性：即使细胞上层的液体介质中包含了所有细胞生长繁殖所需要的营养成分，此种介质也无法诱导细胞增殖。但是，一旦在这种介质中加入小牛或胎牛血清，细胞就可增殖，这是因为血清中含有促使细胞增生的生长因子。上皮生长因子（EGF）是第一个被发现的生长因子，它对多种上皮细胞具有促分裂作用。EGF可结合于某些细胞表面并刺激其生长，而无法与EGF结合的细胞则对其有丝分裂原作用无反应。这些观察结果提示可能存在一种细胞表面蛋白——EGF受体（EGF-R），它可特异性识别并结合胞外的EGF，将信息向胞内传递。
分离EGFR蛋白极具挑战，因为该受体和其他很多受体一样在细胞内的表达水平非常低。研究者通过使用子宫上皮癌细胞（其表达的EGFR比正常水平高100倍）解决了这个问题。对EGF-R分离纯化并进行氨基酸序列分析，可以帮助我们了解该蛋白的结构特征以及这一结构如何发挥功能。对该胞内结构域的检测显示，它与已知的Src蛋白质序列有明确的序列相似性。EGF受体如何在胞内释放信号这一问题的答案瞬间变得清晰起来：一旦其胞外结构域结合EGF, 其胞内结构域的Src样激酶将以某种方式被激活，之后磷酸化某些胞内蛋白质的酪氨酸残基，从而使细胞增殖。
正常细胞通过从其培养基中获得生长因子而维持生长，然而癌细胞在生长和生存过程中对生长因子的依赖性则大大降低。ErbB-EGFR间的关系为癌细胞这一特性提供了一个简单明了的解释：ErbB 癌蛋白所释放的信号与那些经配体激活的EGFR所释放的信号非常相似，不同于EGFR的是，ErbB癌蛋白可以持续不断地向细胞内发放生长剌激信号，从而使细胞认为周围存在着大量的EGF。生长因子受体与配体结合后，其激酶结构域被激活，磷酸化某些胞内蛋白质的酪氨酸残基，从而使细胞增殖。这又引发了一个问题：生长因子受体与配体结合后，是怎样利用它们的酪氨酸激酶结构域来发出信号的呢？在没有配体的情况下，生长因子受体通常以单体形式嵌入质膜。当其生长因子配体（配体为同源二聚体）存在时，受体分子就会结合在配体两个亚基中的一个上。其后，配体-受体复合物将在质膜上徘徊直到有第二次机会遇到另一个受体分子，配体中没有结合受体的那个亚基将和第二个受体分子结合。这样，通过二聚体形式的配体为桥梁，两个受体分子成功地交联在一起。两个受体分子的胞外结构域通过与配体结合而发生二聚化，胞质部分通常也会被拉在一起。每个激酶结构域磷酸化另一受体胞质结构域里的酪氨酸残基，这种双向的相互磷酸化作用被称为转磷酸作用。受体的二聚化模型解释了生长因子受体分子的过表达如何参与肿瘤的形成：生长因子受体在细胞表面的表达水平远远超过了正常细胞，由于受体分子可以自由地在质膜平面横向迁移，它们的高数量使得分子之间经常发生碰撞，这种碰撞类似配体结合所引发的受体二聚化并导致转磷酸作用、受体激活和信号传递。膜蛋白是研究热点，如病毒入侵受体，免疫检查点分子等。目前，我们可用多个数据库查阅膜蛋白及配体/受体信息。除了数据库，最靠谱的受体筛选方法是CRIPSR基因编辑技术和高通量转染。基因编辑技术不再赘述，高通量筛选（High throughput screening，HTS）指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的体系，具有微量、快速、灵敏和准确等特点。简言之，一次实验获得大量信息，并从中找到有价值的信息（大海捞针）。G蛋白偶联受体数据库：https://gpcrdb.org/
TCR数据库：https://tcr3d.ibbr.umd.edu/
人类细胞膜受体数据库（Human Plasma Membrane Receptome）：http://receptome.org/
配体/受体结合数据库：http://www.bindingdb.org/bind/index.jsp
膜蛋白图谱数据库：http://wlab.ethz.ch/cspa/
药物配体和底物数据库：https://www.guidetopharmacology.org/
建议：“表达有差异，差异影响表型”可指导我们的课题。在差异基因影响表型这部分，分子机制是非常关键的。我们对于转录因子、激酶、配体和受体等概念要非常清楚，才能做好机制研究。
