文献速递 | 反义寡核苷酸的优化和应用

为了弥补对药物样特性的追求，很多化学修饰，包括硫代磷酸酯和高亲和糖修饰，会破坏ASO的特异性。ASOs与生物组分的脱靶相互作用构成了临床安全问题。ASO的脱靶相互作用可分为两种类型:依赖杂交和不依赖杂交。前者出现在ASO以序列依赖的方式与非预期RNA结合时。后者源于ASO和蛋白质之间的非特异性相互作用，由核苷酸序列或硫代骨架相互作用促进，并且与杂交无关。同时有效地减少与RNA和蛋白质的非特异性相互作用，或许可以减少反义核苷酸的脱靶作用。

在这篇文章中作者设计了一种ASO纳米结构，称为治疗性ASO (BROTHERS)或BRO(图1)。BRO是一种双链结构，由典型的“gapmer”ASO和部分互补的肽核酸(PNA)链组成，后者被称为“兄弟链或BS”(图1a, b)。BRO突出的缺口区域被称为“支点结构域”，ASO被设计用于结合序列匹配的RNA以启动ASO杂交。剩下的部分称为“双工域”。BS作为一种安全装置，通过隐藏核碱基的官能团和拉直磷硫酸(PS)主链来减少非特异性相互作用，这两者通常被生物分子用作相互作用的支架。PNA是一种人工核酸类似物，具有核碱基连接的不带电N(2-氨基乙基)甘氨酸主链单元(图1b)。PNA对核酸酶和蛋白酶都具有很高的抗性，并且具有前所未有的能力，可以通过沃森-克里克氢键与相应的反平行和异常平行DNA和RNA进行高亲和力杂交，形成半带电荷的非典型双链。此外，PNA本身似乎具有比ASO与硫代磷酸酯(PS)化学明显更小的非特异性蛋白质相互作用特性。因此，非典型的ASO/PNA杂交体预计具有较低的蛋白质结合能力和理想的热力学稳定性(图1c，机制1)。粘性末端介导的链位移(TMSD)机制的BRO系统使ASO能够避免小的错配或凸起，并减少杂交依赖的脱靶结合(图1c，机制2)。

图1.BRO技术的概念和减少脱靶作用的机制。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-43714-0

无义突变是超过10%的人类遗传疾病的基础，包括囊性纤维化、阿拉吉尔综合征、杜氏肌营养不良症、Rett综合征和遗传性癌症，这些疾病缺乏有效的治疗方法。无义突变-有义密码子突变以停止密码子-导致翻译过早终止，产生截短的蛋白质和无义介导的mRNA衰变，导致功能丧失或功能获得表型。恢复全长翻译是治疗无意义相关疾病的首要目标。然而，即使是全长产品的部分修复也可能提供显著的治疗效益。

在真核生物中，意义密码子由氨基酰基tRNA（aa - tRNA）识别和解码，而停止密码子（UAA、UAG和UGA）则由释放因子eRF1识别。要发生通读，无义密码子必须由aa-tRNA而不是eRF1读取，这样一个氨基酸就被纳入其中，允许翻译继续到开放阅读框末端的正常终止密码子。无义密码子的解读可以通过aa-tRNA增强终止密码子解码，抑制终止，或两者兼有来诱导。结构和生化研究揭示了解码和终止之间的关键区别。aa-tRNA通过在解码中心形成三个碱基对来识别密码子，而eRF1则与终止密码子以及终止密码子后的核苷酸相互作用，就像将mRNA“拉”进了入口通道。事实上，较长的mRNA片段在终止过程中比在aa-tRNA解码过程中受到核糖体的保护。我们假设干扰进入通道的mRNA动力学可能因此抑制终止并刺激无义读取。

反义寡核苷酸（ASO）是调节基因表达的有力工具，因为它们通过沃森-克里克碱基配对获得了高特异性。文中提出了一种新的ASO作用模式，使R-ASO结合停止密码子下游的特定位置来诱导读通。这些诱导读通的反义寡核苷酸，可以将哺乳动物翻译系统中含有无义mRNA的翻译恢复到可能与治疗相关的水平。使用最近开发的动力学分析，文中R-ASO以特定于上下文的方式抑制翻译终止，与假设的作用机制一致。R-ASO与其他读透诱导剂（G418或抑制因子tRNA）之间的协同作用提示了一种诱导特定致病无义密码子读透的方法。这种无义解读新机制的概念性论证，是针对数百种严重遗传疾病的mrna特异性治疗迈出的重要一步。

图2.利用纳米荧光酶报告基因作为兔网织细胞裂解液中全蛋白读数，测量终止密码子翻译效率的实验系统。(A)用于体外翻译反应的模型mRNA方案。(B)本研究中使用的体外翻译实验方案。

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkae624

利用非侵入性刺激控制基因在细胞中向蛋白质的自由表达对DNA纳米器件和合成细胞的未来应用至关重要。然而，很少有人重视开发用于无细胞表达的光控“关闭”开关。光激活反义寡核苷酸已被开发用于诱导活细胞中的基因敲低。开发简单易行的方法来生产光激活反义寡核苷酸对于其在无细胞生物学和生物技术中的应用至关重要。

这种简单易行的技术将在光控生物逻辑门和调节合成细胞的活性方面有未来的应用。

文中报道了一种温和的一步法，利用磷硫酸盐(PS)骨架修饰结合商业上可用的卤化光笼前体，2-硝基溴(图3)，将光笼连接在骨架上，显著降低了ASO形成双相的能力。杂交能力的降低和ASO上的立体体积的结合，使光控RNase H介导的靶向信使RNA (mRNA)的切割成为可能。然后，作者应用这些ps光笼化的asos来控制无细胞蛋白合成中的基因敲低。

所得到的笼状ASOs生产简单，定义明确，并且允许磷酸化ASO的光释放，使光控无细胞敲除成为可能。此外，含有硫代磷酸酯的ASO的释放将能够与含有核酸酶的更容易获得的裂解物为基础的系统一起使用。

图3.含ps的反义寡核苷酸的修饰及其在RNase H介导的基因敲低中的应用。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s42004-023-00860-2

蒂莫西综合征1型(TS1或TS)是由CACNA1C基因8A外显子c.1216G> A杂合致病变异导致l型电压门控钙通道CaV1.2 α1亚基p.G406R错配变异引起的一种发病率和死亡率显著的严重遗传性疾病。

在这篇文章中，作者开发了一种基于反义寡核苷酸(ASO)的干预方法，可以有效地减少来自三个TS个体和一个等基因G406R hiPS细胞系的神经细胞的外显子8A包涵。本文首次证明了TS1 p.G406R突变直接增强了突变外显子8A的剪接。随后筛选了能够以时间和剂量依赖的方式强烈抑制外显子8A剪接的ASO。将这些ASO直接应用于来自TS个体的二维或三维培养的人类皮质神经元，可以挽救延迟通道失活和去极化诱导的钙升高缺陷。

此外，这些ASO恢复了先前在TS1前脑集合体中发现的皮层神经元间迁移缺陷。最后，为了验证ASO在体内环境中的有效性，作者利用了其最近开发的移植模型。在这个系统中，人类干细胞衍生的皮质类器官移植(t-hCO)到新生胸腺大鼠的体感觉皮层中生长并发育成熟的细胞类型，这些细胞类型整合到感觉和动机相关的回路中。鞘内注射ASO给移植了人类TS1皮质类器官的大鼠，会导致外显子8A的显著下调，同时挽救去极化诱导的钙缺陷和异常的活动依赖的树突形态。综上所述，这些实验展示了一种新的基因拯救策略，用于治疗一种毁灭性的神经发育障碍。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07310-6

M3R Lab

作者｜tym

审核｜sj

排版｜xjc