专题文献速递 | 引物编辑（Prime Editing）新进展

背景

Figure 1 PE 的机制

由刘如谦教授团队提出的引物编辑（Prime Editor，PE）系统可以在不产生DSB的情况下精确安装碱基替换、小片段的插入和删除。其由两部分组成：DNA切口酶（nickase）与工程逆转录酶（RT）的融合蛋白；PE引导RNA——pegRNA。pegRNA包含一个指定目标位点的间隔体（spacer），一个单引导RNA（sgRNA）支架和一个编码所需编辑的3'端片段。该3'端扩展包含一个引物结合位点（PBS），互补的一部分DNA原间隔和一个RT模板，编码所需的编辑和下游基因组序列。PE系统与靶位点结合后，将含有PAM序列的DNA链切出，切出的DNA链碱基对与pegRNA中的PBS结合，从而将反转录的编辑序列直接引到靶DNA位点。新合成的编辑DNA的3'端随后通过细胞DNA修复途径替换，最终在目标位置进行所需的编辑（图1）。

通过将PE系统组分进行密码子优化，酶的点突变，引入nickingRNA等优化手段，刘如谦课题组开发了PE2，PEmax，PE5等升级系统。与位点特异性重组酶（SSR）联用，还实现了哺乳动物细胞中的大片段DNA的删除、反转和精确整合，丰富了基因编辑工具并为基因疾病的治疗提供了新的思路。本期文献速递将介绍最新几项关于PE编辑系统的优化和应用的工作。

传统的哺乳动物基因组靶向整合基因的方法存在可编程性低、效率低或特异性低等问题。为了进一步提高整合的效率，来自麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所的刘如谦团队结合了原有引物编辑（PE）系统的可编程性和重组酶精确整合超过10kb大DNA片段的能力，提出了名为PASSIGE的基因编辑技术（图2a），该工作于2024年6月10日发表（Nat Biomed Eng. 2024:1-18）。研究人员通过噬菌体辅助连续进化（PACE）技术对Bxb1重组酶进行优化，从而显著提高PASSIGE的效率。

噬菌体辅助连续进化（PACE）技术（图2b），是一种蛋白质定向进化方法。这种技术将生物分子的实验室进化和噬菌体的生命周期结合在一起，让蛋白质在每24小时内进化60轮。选择噬菌体（SP）编码正在进化的蛋白质，宿主大肠杆菌细胞编码诱变质粒（MP），质粒将进化蛋白的活性与噬菌体必需基因gIII的表达联系起来。只有编码活性变体的噬菌体才会触发gIII表达和传播。通过模拟物竞天择的自然进化过程，经过数百小时的繁殖，对噬菌体进行达尔文进化选择，由此快速产生具有全新结构的重组酶变体。

Figure 2 PASSIGE和PACE技术原理

作者进化和工程改造了Bxb1重组酶变体（evoBxb1和eeBxb1），便显出显著的活性提升，将 PASSIGE与evoBxb1或eeBxb1一起使用称为evoPASSIGE或eePASSIGE。在预装重组酶着陆位点（attB/P）的人细胞系中介导了高达 60% 的供体整合（为野生型Bxb1的3.2倍）。

作者在优化了PASSIGE系统后，证明了evoPASSIGE和eePASSIGE的优越性：在安全港和治疗相关位点的单次转染实验中，带有eeBxb1的PASSIGE可以实现20-46%的数kb基因大小的cargo整合，平均靶向基因整合效率为23%（为野生型Bxb1的4.2倍），evoBxb1的基因整合效率也提高了2.7倍（图3）。也验证了evoPASSIGE和eePASSIGE系统可以在多种细胞系（HEK293T、N2a、Huh7、原代人成纤维细胞和人iPS细胞）中有效编辑，并且，值得一提的是，在原代人成纤维细胞的多个位点，整合效率超过30%（图4d），是迄今为止在哺乳动物细胞中报道的最高的RNA引导的基因组整合效率之一，超过了已知的挽救各种功能丧失遗传病的基因编辑效率。evoPASSIGE和eePASSIGE的性能分别平均分别比 PASTE（另一种使用引物编辑器与重组酶融合的基因编辑方法）高出9.1倍和16倍，证明了该技术在治疗相关基因整合方面的潜力。

Figure 3 所有位点中evoPASSIGE和eePASSIGE的整合效率相对于PASSIGE的倍数变化

Figure 4 在不同细胞系中评估 PASSIGE 变体的治疗潜力

总而言之，这篇文章展示了通过PACE技术进化Bxb1重组酶，显著提高了PASSIGE基因整合效率，为基因治疗和合成生物学提供了新的工具。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41551-024-01227-1

目前，许多研究试图构建增强的PE编辑系统，主要集中在提高编辑效率上。为了安装编辑，PE蛋白结合pegRNA，并在该pegRNA的间隔序列的指导下，找到互补的DNA靶标。一旦与靶标结合，编辑复合物就会刻开一条移位的DNA链并释放出3’DNA末端。然后，该末端可以与pegRNA的3'延伸和pegRNA编码编辑的引物逆转录杂交，最终掺入基因组或被DNA错配修复（MMR）去除。已经报道了影响PE编辑效率的几个特征，包括编辑组分的表达、稳定性、定位和活性，以及靶向基因座的染色质背景。当MMR被抑制或规避时，可以更高效地安装小的PE编辑。

为了确定PE编辑的其他决定因素，普林斯顿大学Adamson教授团队于2024年4月3日在Nature上发表了题为：Improving prime editing with an endogenous small RNA-binding protein.（Nature, 2024;628(8008):639-647）的研究论文。本研究进行了基因组规模的CRISPR干扰（CRISPRi）筛选，从中确定了一个关键介质：小RNA结合蛋白La。

La（内源性RNA结合蛋白）是一种广泛表达的真核蛋白，参与RNA代谢的多个方面，其最显著的特征之一是结合新生RNA聚合酶III（Pol III）转录本3’端的多聚尿苷（polyU），并保护它们免受外切核酸酶的破坏。进一步研究显示，La促进跨方法（PE2、PE3、PE4和PE5）、编辑类型（替换、插入和缺失）、内源性基因座和细胞类型的PE编辑（图5），但对依赖于标准、未延伸gRNA的基因组编辑方法没有一致的影响。

Figure 5 La促进不同编辑类型，不同细胞类型和内源性基因座的基因编辑效率

以前的研究表明，La在RNA聚合酶III转录本的3’末端结合聚尿苷，研究人员发现La在功能上与多尿苷化引物编辑向导RNA（pegRNA）的3’末端相互作用。在这些结果的指导下开发了一种与La的RNA结合N末端结构域融合的引物编辑器蛋白（PE7）。该编辑器使用了优化La结合的合成pegRNA，提高了PE编辑效率（图6）。

接下来，作者评估了PE7在多个疾病治疗相关靶点上的编辑效果，包括镰状细胞病（HBB）、朊病毒病（PRNP）、家族性高胆固醇血症（PCSK9）、过继T细胞转移疗法（IL2RB）、艾滋病（CXCR4）和CDKL5缺乏症（CDKL5）相关靶点。值得一提的是，在U2OS细胞系中，与PEmax相比，PE7的编辑效率提升了10倍以上（图7）。

Figure 6 La在功能上与多尿苷化pegRNA的 3' 末端相互作用，融合La蛋白开发PE7系统

Figure 7 PE7可增强U2OS细胞中疾病相关靶点（上）和原代人类细胞（下）的PE编辑

总之，通过鉴定和表征La作为PE编辑的关键细胞决定因素，本研究扩大了对PE编辑成分如何与细胞环境相互作用提供了关键见解，并提出了稳定其中外源性小RNA的一般策略，展示了提高PE编辑效率的方法，并为未来的优化提出了有用的途径。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07259-6

囊性纤维化（Cystic Fibrosis，CF）是一种由CFTR基因突变导致的常染色体隐性遗传疾病，目前已鉴定出超过数千种CFTR基因突变，其中超过700种突变会导致囊性纤维化病变，其中85%的患者存在同一种突变——CFTR F508del，即CFTR基因中三核苷酸CTT缺失，导致CFTR蛋白中第508位的苯丙氨酸缺失。

小分子疗法在临床上被证明有效，但弊端是患者需要终生治疗。基于此，基因编辑代替疗法有希望从源头精确修正CFTR F508del突变，从而为患者提供一种根本的治疗方法。与上述简介一致，因为引物编辑无需依赖DNA模板就能在基因组中实现各种各样较短的替换、插入和删除，且一定程度上能够抵抗脱靶编辑。与Cas9等核酸酶介导的基因编辑相比，PE编辑不会产生DNA双链断裂，因此能够最小化不受控的插入和缺失突变、大片段缺失、p53激活等不良结果。2024年7月10日，刘如谦教授团队利用PE编辑治疗囊性纤维化基因突变的相关工作发表在Nature子刊上：Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells（Nat Biomed Eng, 2024）。

研究人员使用PE2和PE3系统来修正CFTR F508del突变，但编辑效率不足0.5%。通过PE编辑技术的最新优化策略（工程化pegRNA、PEmax结构，瞬时表达显性错配修复蛋白（MLH1dn），策略性沉默编辑，使用PACE进化的逆转录酶变体（PE6）、近端失活gRNA等）(图8，9)，在永生化的人支气管上皮细胞模型中实现了高达58％的CFTR F508del修正效率（提高 140 倍），在囊性纤维化患者来源的原代气道上皮细胞中达到了25％的修正效率，实现了恢复CFTR依赖性阴离子通道活性。

Figure 8 部分PE系统优化示意图，具有改进F508del校正的增强功能。增强功能包括（5） epegRNA 3’ 结构RNA基序，（6）MLH1dn的共表达，（7）逃避细胞错配修复的翻译沉默编辑，（8）工程化和进化的PE编辑器蛋白（PEmax和PE6）。

Figure 9 使用epegRNA、沉默编辑、PE6c和dsgRNA进行F508del校正的组合改进

这些优化还带来了最小的脱靶编辑，成功编辑与插入/缺失突变（indel）的比率比Cas9核酸酶介导的同源定向修复（HDR）的比率高出3.5倍，并且在囊性纤维化患者的原代气道细胞中使CFTR离子通道的功能恢复到正常水平的50%（图10）（与使用elexacaftor、tezacaftor和ivacaftor等小分子药物联合治疗所达到的水平相当）。因此，研究结果支持对CF进行持久的、一次性治疗的可行性。

Figure 10 PE纠正CF患者原代气道上皮细胞中的CFTR F508del并挽救离子通道功能

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41551-024-01233-3

如上文提及，刘如谦教授团队通过噬菌体辅助连续进化（PACE），得到不同的逆转录酶变体，开发了新型PE编辑器（PE6a–d）。这些逆转录酶（RT）变体分别来自大肠杆菌Ec48重组子、酵母Tf1逆转录转座子和M-MLV。

2024年7月9日，中国农业大学陈其军团队研究了四种新型PE编辑器（PE6a–d）在转基因水稻中的编辑效率，发现其中PE6c表现出最高的编辑效率。相关工作发表于Journal of Integrative Plant Biology（J Integr Plant Biol, 2024:jipb.13738）。

Figure 11 用于编辑水稻植物的PE系统组成

在这项研究中，研究人员在转基因水稻（Oryza sativa）植物中测试了四种 PE6变体和两种带有双RT模块的附加PE6构建体的编辑效率（图11）。PE6c具有来自酵母Tf1逆转录转座酶变体，产生了最高的PE编辑效率。与PEmax相比，PE6c编辑效率在15个基因的18个农艺重要靶位点的编辑效率平均倍数变化超过3.5。这些靶点涉及水稻的理想株型、氮利用效率、除草剂抗性、生物和非生物胁迫抗性等多个农艺性状。此外，该研究还证明了使用两个RT模块提高引物编辑效率的可行性：PE6db和PE6bd在上述靶点也表现出显著的编辑效率提升，分别提高了3.1倍和2.1倍（图12）。表明PE系统可以进行多模块化设计，是一种有效的优化策略，并且在水稻物种层面上得到了验证。

作者的结果表明，PE6c或其衍生物将是单子叶植物PE编辑的绝佳选择。通过引入双RT模块，大幅提高了水稻基因组编辑的效率。这一研究不仅在技术上具有创新性和突破性，还为基于PE编辑的水稻品种育种奠定了基础和实践支持，在农业农艺上具有广泛的应用前景。

Figure 12 PE6变体相对于PE3，在15个基因的18个农艺重要靶标上的PE编辑效率的倍数变化

原文链接：https://doi.org/10.1111/jipb.13738

PE编辑的效率在不同的目标位点之间可能会有很大差异，并且受到PE编辑向导RNA（pegRNA）设计的强烈影响。因此，实现高的PE速率通常需要通过筛选多个pegRNA设计来优化pegRNA的特定部分，包括RNA二级结构，序列组成等，费时费力。

2024年6月21日，来自瑞士苏黎世大学的Krauthammer和Schwank教授团队在子刊Nature Biotechnology上发表了最新的研究成果：Machine learning prediction of prime editing efficiency across diverse chromatin contexts。该研究开发了能够可靠地预测PE编辑效率的机器学习模型PRIDICT2.0/ePRIDICT。

研究人员之前已经开发了在广泛的PE编辑数据集上训练的机器学习模型来预测pegRNA的效率。这些模型的一个共同局限性是它们限制在预测某些编辑类型，比如：DeepPrime4仅限于1到3bp的编辑；MinsePIE3仅限于某些插入；PRIDICT1主要关注1bp的替换以及短的插入和缺失等等。此外，这些模型都没有解释局部染色质状态对编辑速率的潜在影响。在本篇研究中，研究人员通过开发两个互补的计算模型来解决这些缺点（图13上）。PRIDICT2.0（图13左下）是一个基于两个模型预测平均值的集成模型：Model A基于文库1训练并基于Library-Diverse进行微调，Model B基于文库1和Library-ClinVar4训练，然后在Library-Diverse上进行微调。随后，研究人员在不同环境中（不同细胞系，不同基因编辑类型：1bp替换，多碱基替换，片段插入，删除）验证PRIDICT2.0的预测准确性并与现有模型进行比较（图13右下）。随后，研究人员又训练了一系列线性和基于树的机器学习模型，以预测染色质特性对引物编辑效率的影响。显示预测编辑率和实验观察到的编辑率之间相关性最高的模型基于XGBoost框架，并被命名为ePRIDICT，用于“基于表观遗传学的PE编辑效率预测”。

作者通过验证得到，PRIDICT2.0可以评估pegRNA在错配修复缺陷型、错配修复细胞系以及原代细胞体内长度不超过15bp的所有编辑类型的性能，能够更可靠地预测PE编辑效率。并且，借助ePRIDICT进一步开发了新模型，该模型能够量化局部染色质环境如何影响PE编辑率。

Figure 13 具有靶标匹配的pegRNA文库Library-Diverse的筛选示意图（上），PRIDICT2.0预测模型以及预测效果（下）

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-024-02268-2