文献速递 | CRISPR-Cas9在肠道微生物组中的创新应用

背景

Bacteroides(拟杆菌属)是肠道中重要的共生菌属，参与人体的消化、免疫调节和抗病原防御。然而目前针对此类肠道微生物的基因编辑工具仍有一定的局限性。于2022年在ACS Synthetic Biology上刊登的《CRISPR/Cas-Based Genome Editing for Human Gut Commensal Bacteroides Species》一文指出，该研究团队成功设计了一个高效的CRISPR-Cas9系统，使其能够在Bacteroides中实现精确的基因敲除和定点突变。

研究团队将诱导性启动子P1T_DP^GH023与Pbt1311结合，作为Cas蛋白的表达启动子，并为Bacteroides设计了定制的sgRNA，确保其能精确识别并结合目标基因DNA序列，从而高效引导Cas9蛋白进行DNA切割。通过靶向RGI-PUL基因簇，研究人员成功实现了对Bacteroides特定基因位点的删除。此外，研究者还基于CRISPR/Cas9系统成功在Bacteroides中插入了荧光报告基因gfp，并通过代谢产物分析和基因表达检测评估了CRISPR系统对菌株功能的影响。

研究结果表明，CRISPR/Cas9系统能够显著调控Bacteroides的代谢功能，揭示了某些基因在代谢途径和宿主免疫反应中的关键作用。这一技术为肠道微生物组的研究提供了新工具，能够在精准调控Bacteroides菌株功能方面发挥重要作用。研究为个性化治疗和肠道健康干预提供了有力支持，并为未来的肠道微生物学研究开辟了新思路。

图1：CRISPR系统可有效实现对多形拟杆菌的基因删除和插入

原文链接：https://doi.org/10.1021/acssynbio.1c00543

尽管CRISPR-Cas9技术在细菌基因组编辑中取得了成功，但在复杂的肠道微生物群落中实现特定菌株的去除仍然是一个难题。于2021年在Cell Reports上刊登的《Phage-delivered CRISPR-Cas9 for strain-specific depletion and genomic deletions in the gut microbiome》一文中，研究者设计并构建了一种特殊的噬菌体，其能够递送CRISPR-Cas9系统至肠道微生物中的特定菌株以实现基因编辑。

研究人员构建了与噬菌体M13兼容的绿色荧光蛋白（GFP）靶向的CRISPR-Cas9载体，并将其包装入M13中，命名为GFPT-M13。在实验中，研究人员将携带GFP和mCherry报告基因的两种不同标记的大肠杆菌菌株共培养于链霉素处理的小鼠肠道中。随后，小鼠分别口服了NT-M13噬菌体（不携带CRISPR-Cas9系统）和GFPT-M13噬菌体（携带CRISPR-Cas9系统并包含GFP报告基因）。在实验的4只小鼠中，GFPT-M13组显示mCherry+菌株在第7天和第14天逐渐固定，且GFP+事件降至背景水平，而NT-M13组则未出现这一变化。这表明GFPT-M13噬菌体成功实现了目标菌株的去除，并且这种去除效果是序列特异性的。

为了进一步量化CRISPR-Cas9系统的基因删除效率，研究人员构建了一个双标记的大肠杆菌菌株，携带GFP和mCherry报告基因。在GFPT-M13组的小鼠中，检测到GFP- mCherry+菌株，表明CRISPR-Cas9系统成功地通过噬菌体递送并激活，导致目标菌株发生了GFP基因的删除，而mCherry基因保留。这些结果表明，使用M13递送的CRISPR-Cas9系统能够在小鼠肠道微生物群中特异性地删除目标细菌基因。

文章展示了通过M13噬菌体递送CRISPR-Cas9系统，可以在小鼠肠道微生物群中精确去除特定菌株并实现基因组删除。噬菌体作为基因编辑工具的递送载体，能够在无需抗生素选择的情况下，进行精准的微生物群调控，具有极大的应用潜力，尤其是在肠道微生物调控和疾病治疗方面。

图2：通过M13传递的CRISPR-Cas9可诱导小鼠肠道中大肠杆菌目标基因的染色体缺失

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109930

虽然噬菌体具有高感染性等优势，但它们的宿主范围通常较窄，且体内的环境条件（如pH、胃液、免疫反应等）会极大限制其在肠道中的活性。为了克服这些限制，研究者们探索了更具广泛应用潜力的载体——工程化益生菌。与噬菌体相比，益生菌不仅可以在肠道中长期定植，还能借助细菌共轭传递系统，通过高效的基因传递方式克服环境的挑战。2021年在Molecular Systems Biology上刊登的文章《Engineering of CRISPR-Cas systems for efficient delivery and precision targeting of bacterial genomes in the gut microbiome》一文中，研究者成功构建了一种基于细菌共轭转移的益生菌载体，并利用TP114质粒作为基因传递工具，将CRISPR-Cas9系统递送至肠道中的特定致病菌株。

研究人员首先筛选了肠道中常见的共轭质粒，确定了 TP114 质粒作为高效的 DNA 转移工具，在肠道环境中能够高效进行共轭转移。通过实验室加速进化，获得了改良版 TP114 质粒 eB-TP114，该质粒具有更高的共轭转移效率。接着，研究人员将 CRISPR-Cas9 基因编辑系统引入 eB-TP114，生成了 eB-COP 工程益生菌菌株。

在小鼠实验中，研究人员将靶菌株 EcN KN02 与非靶菌株 EcN KN03 以 1,000:1 的比例口服给小鼠，并分别使用不含 CRISPR-Cas9 的 eB-TP114 和含 CRISPR-Cas9 系统的 eB-COP 作为处理组。结果表明，在对照组中，靶菌与非靶菌的比例变化较小，而在 eB-COP 处理组中，靶菌 EcN KN02 的数量在 12 小时内减少了约 95%，并在 2 天后几乎完全清除，达到 99.5% 的去除率。4 天后，eB-COP 组靶菌数量比对照组减少了超过 4,000 倍，清除率超过 99.9%。

这项研究展示了通过工程益生菌递送 CRISPR-Cas9 系统，可以高效去除肠道中的特定抗药性病原菌，克服了传统噬菌体或转化方法中效率低的瓶颈。利用共轭转移系统传递 CRISPR-Cas9 基因编辑工具，为肠道微生物的精准调控提供了新的策略，并具有巨大的临床应用前景，尤其在抗药性菌株的去除和肠道健康干预方面。

图3：eB-COP系统可以重塑肠道细菌群落

原文链接：https://doi.org/10.15252/msb.202110335

近日，在发表在ACS NANO上的一文《Oral Microto-Nano Genome-Editing System Enabling Targeted Delivery and Conditional Activation of CRISPR-Cas9 for Gene Therapy of Inflammatory Bowel Disease》中，研究团队设计并实现了一种创新的口服纳米尺度基因编辑系统（RNP-NCs@dOMV@CAM），用于靶向递送和条件性激活CRISPR-Cas9系统，以治疗炎症性肠病（IBD）。

研究者通过使用炎症响应性的二硫键将Cas9/sgRNA RNP（核糖核酸蛋白复合物）连接，形成了RNP纳米簇（RNP-NCs）。这些RNP-NCs被大肠杆菌Nissle 1917（EcN）的外膜囊泡（OMVs）包裹，构成了RNP-NCs@dOMV。为了提高该系统对胃部降解的抵抗力并确保在肠道内的响应性释放，研究者将钙藻酸盐（CAM）涂层添加到RNP-NCs@dOMV外层，形成了RNP-NCs@dOMV@CAM。

为了阐明RNP-NCs@dOMV@CAM在减轻DSS（葡聚糖硫酸钠）诱导的炎症性肠病（IBD）中的作用机制，研究团队进行了多项分析，并以DSS处理的小鼠为对照组。首先，通过T7EI错配检测法评估了TNF-α基因位点的indel频率，结果显示，RNP-NCs@dOMV@CAM组的indel频率为12.4%，而其他处理组未检测到切割带，表明CRISPR/Cas9编辑在该基因位点的成功实施。进一步的组织离靶效应分析显示，DSS组小鼠的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）未观察到显著的indel突变，突变仅出现在结肠的TNF-α位点，证明了RNP-NCs@dOMV@CAM的结肠特异性靶向性。

此外，RNP-NCs@dOMV@CAM显著减少了DSS组小鼠结肠中的中性粒细胞积聚和炎症反应，并促进了组织修复，进一步验证了其抗炎和修复作用。此研究展示了CRISPR-Cas9系统与口服纳米颗粒递送技术相结合，成功实现了对IBD的基因治疗，揭示了基因编辑在肠道疾病治疗中的巨大潜力，为IBD的精准治疗和其他肠道相关疾病的基因治疗提供了新的思路。

图4：RNP-NCs@dOMV@CAM 介导的体内炎症基因组编辑

原文链接：https://doi.org/10.1021/acsnano.4c07750