背景
01
融合脱氨酶结构域的迷你碱基编辑器
2023年，杨辉团队通过将 enIscB 与 T5 核酸外切酶 (T5E) 融合，发现 enIscB-T5E 表现出与 SpG Cas9 相当的靶向效率，同时在人类细胞中表现出降低的染色体易位效应。此外，通过将胞嘧啶或腺苷脱氨酶与 enIscB 切口酶融合，开发出高效迷你型IscB 衍生的碱基编辑器 (miBE)，其表现出了强大的编辑效率（高达 92%）来诱导 DNA 碱基转换。工作确立了 enIscB-T5E 和 miBE 作为基因组编辑的多功能工具的地位1。2024年8月15日，杨辉团队以 “Engineered IscB–ωRNA system with expanded target range for base editing”为题，在Nature Chemical Biology上发表研究论文2。该研究通过宏基因组数据挖掘，鉴定出新型IscB-ωRNA系统；通过各种技术手段，成功获得识别范围广、更高效编辑活性的IscB系统(IscB.m16*)；通过融合脱氨酶结构域，进一步开发出基于新型IscB的迷你型腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器。
作为 Cas9 核酸酶的进化祖先，IscB 蛋白是一种紧凑型 RNA 引导的 DNA 内切酶和缺口酶，因此是碱基编辑的有力候选者。然而，狭窄的靶向范围限制了 IscB 系统的应用；因此，有必要找到更多可识别不同靶邻接基序(TAM)的 IscB。在本文中，团队通过分析鉴定大量基因组数据，发现了19个具有不同TAM范围的天然IscB-ωRNA系统。其中10个蛋白在哺乳动物细胞中具有活性。通过蛋白质和ωRNA工程，进一步增强了IscB直向同源物IscB.m16的活性，并扩大其TAM范围，从而产生了一种名为IscB.m16*的变体。通过将脱氨酶结构域与 IscB.m16* 缺口酶融合，产生了 IscB.m16* 衍生的碱基编辑器。
IscB.m16* 衍生的碱基编辑器在某些疾病相关基因座(如 DMD)中表现出与 SpG-BE 相当的编辑活性，甚至比 SpG-BE 和 enOgeuIscB-BE 更高的编辑活性。在哺乳动物细胞和小鼠疾病模型中包括SpCas9-BE无活性的疾病位点上均展现了强大的碱基编辑效率和广泛的靶标识别能力。考虑到它们紧凑的尺寸和扩展的编辑范围，IscBm16* 衍生的碱基编辑器有可能成为基于 AAV 的治疗应用的 enOgeuIscB 衍生和 Cas9 衍生的碱基编辑器的替代品。因此，这项研究为基础研究和治疗应用建立了一套新的紧凑的碱基编辑工具。
图1 功能性 IscB 直系同源物的鉴定和表征；对 IscB.m16 进行蛋白质工程改造；基于 IscB.m16* 的胞嘧啶碱基编辑器介导有效的碱基编辑并恢复人源化 DMD E51del小鼠中的肌营养不良蛋白表达。
鉴于在设计 IscB 核酸酶和 ωRNA 方面获得的经验，可以使用类似的策略改进和扩展其他 IscB 直系同源物（如 OgeuIscB）的活性和 TAM 编辑范围。与 IscB.m16* 一起，一组工程化的 IscB 直系同源物可能构成一个微型基因组碱基编辑工具箱。总体而言，经过设计的紧凑型IscB衍生碱基编辑器，是一个在哺乳动物细胞和小鼠疾病模型中具有高效、特异性和广泛TAM范围的DNA碱基编辑平台，这也凸显了其在基因治疗中的潜力。
类似的，2024年3月29日，华东师范大学李大力、王立人团队以及上海交通大学基础医学院曾凡一课题组合作以“Engineering APOBEC3A deaminase for highly accurate and efficient base editing”为题，在Nature Chemical Biology发表研究论文3。
研究对人类 APOBEC3A(A3A)脱氨酶进行结构指导工程化，开发出了高精度的 A3A-CBE (haA3A-CBE)变体，不受甲基化状态和上下游序列的影响，可以高效地进行 C to T 转换，并且DNA 和 RNA 脱靶活性接近背景水平。工程化的脱氨酶结构域与 PAM 松弛的 SpCas9-NG 变体兼容，可通过单向导RNA (sgRNA) 的灵活定位，能准确校正同源胞嘧啶位点的致病突变。在酪氨酸血症小鼠模型中将一种 haA3A-CBE 变体通过双腺相关病毒递送，可在肝组织中诱导高达 58.1% 的编辑，且旁观者编辑极少，并且通过基于脂质纳米粒子的单剂量信使 RNA 递送 haA3A-CBEs 进一步减少了旁观者编辑。这些结果凸显了 haA3A-CBE 在精准基因组编辑治疗人类疾病方面的巨大潜力(图1)
图1 工程化haA3A-CBEs的体外编辑和体内应用
基因组编辑是一个 “打了就跑 ”的过程，长期表达基因组编辑器会增加副产品，如脱靶突变和旁观者编辑。由于 LNP 递送的碱基编辑器 mRNA 在小鼠肝脏中的存活时间不超过 3 天，研究证明了 haA3A-CBE mRNA 的瞬时表达可减少 FahNS/NS 小鼠的旁观者编辑。多项研究表明，AAV 具有整合潜能和免疫原性，因此 mRNA 递送将是一种更安全、更优越的碱基编辑策略。在此研究中，团队在细胞系和人类疾病动物模型中证明了 haA3A-CBE 在纠正各种序列上下文中的致病性 SNV 方面的显著效率和精确性。使用PAM-relaxed SpCas9-NG与灵活的sgRNA设计相结合，进一步提高了haA3A-CBEs校正人类致病性SNV的准确性。值得注意的是，相当一部分与疾病相关的 T-C 基因突变位于 CpG 二核苷酸（通常是甲基化的）或 GC 矩阵中。haA3A-CBEs 特别适合纠正这些类型的突变，因此有望用于治疗人类疾病，并扩展 CBE 工具包的各种应用。
原文链接：1）https://doi.org/10.1038/s41589-024-01706-1
2）https://doi.org/10.1038/s41589-024-01595-4
02
开发不依赖脱氨酶的碱基编辑器
2024年7月30日，北京大学魏文胜团队以 ‘Programmable DNA pyrimidine base editing via engineered uracil-DNA glycosylase’ 为题，在 Nature Communications 上发表了研究论文4。
DNA 碱基编辑技术主要利用工程脱氨酶，这也限制了它们直接编辑胸腺嘧啶和鸟嘌呤的能力。团队发现人源化尿嘧啶DNA-糖基化酶(hUNG)的两个突变体可以在体外实现对胞嘧啶和胸腺嘧啶的直接切割。基于此，该研究通过构建UNG，利用跨损伤DNA合成途径，成功实现了对胞嘧啶和胸腺嘧啶的直接编辑，并开发了一种不依赖脱氨酶的DNA碱基编辑器——TBE(Thymine base editor)(图1)。其中在报告系统上编辑C的效率可达到30%，与现存的CGBE编辑效率类似，但针对T的hUNG突变体编辑效率较低。
图1 nCas9(D10A)-hUNG突变体靶向报告系统示意图
研究团队在转染HEK293T细胞后，在显微镜下观察到，转染三天后，转染了DrUNG突变体6的细胞比转染其他三个hUNG突变体的细胞更健康，与未处理的细胞相似。此外，转染DrUNG突变体6的细胞的生长速度优于转染三种hUNG突变体的细胞，与未处理的细胞非常接近(图 2)。这表明DrUNG突变体6比hUNG突变体具有更低的细胞毒性。TBE与现有的其他胸腺嘧啶编辑工具相比，编辑效率更高、细胞毒性极低。
图2 DrUNG 突变体 6 比 hUNG 突变体表现出更高的编辑效率和更低的细胞毒性
在研究中，团队尝试将TBE用于治疗Hurler综合征疾病。将DrUNG突变体6的mRNA与缺口酶SpCas9融合蛋白和sgRNA共转染到Hurler综合征细胞GM06214中，获得了约25%的编辑效率，并显著恢复了IDUA的催化活性(图3)。
图3 人类 Hurler 综合征报告系统和用于 TBE 的 sgRNA 设计。
总之，TBEs为碱基编辑提供了高效、精确、低毒的方法，展现出在相关疾病的治疗应用方面的潜力。
类似的，2024年1月2日，中国科学院天津工业生物技术研究所毕昌昊团队和张学礼团队合作，在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Glycosylase-based base editors for efficient T-to-G and C-to-G editing in mammalian cells 的研究论文5。
该研究通过定向进化改造了人源尿嘧啶糖基化酶(UNG)的突变体，获得了胞嘧啶-DNA糖基化酶(CDG4)和胸腺嘧啶-DNA糖基化酶(TDG3)两种高活性的DNA糖基化酶，将它们分别与与nCas9融合，构建了DAF-CBE和DAF-TBE两种不含脱氨基酶碱基编辑器(图1)。
图1 TDG-nCas9 介导的碱基转换过程。
研究团队在大肠杆菌中进行C-to-A和T-to-A的碱基编辑。结果显示，CDG4-nCas9和TDG3-nCas9在大肠杆菌中的编辑效率最高可达58.7％和54.3％。对这两种碱基编辑器进行了人类密码子优化后，在人HEK293T细胞中也成功实现了C-to-G和T-to-G的颠换编辑，编辑效率分别达到38.8%和48.7%。且具有很小的Cas9依赖性和Cas9非依赖性脱靶效应以及最小的RNA脱靶效应(图2)。
图2 HEK293T 细胞中 DAF-CBE 和 TBE 编辑活性的表征
接下来，研究团队对这两种碱基编辑器进行了基因工程改造，开发出了DAF-CBE2和DAF-TBE2，它们的编辑窗口从原间隔区的5′端移动到了中间区域，并将对C-to-G/T-to-G的编辑效率分别提高了3.5倍和1.2倍。DAF-CBE2 和 DAF-TBE2 都具有更高的编辑效率和纯度以及不同的编辑窗口，为 DAF 碱基编辑器的使用提供了更大的灵活性。
目前已发现约 4,800 个 G-C to T-A 的致病性单核苷酸变异(SNV)与人类疾病相关，约占致病性 SNV 总数的 15%。DAF-TBE 具有在人类细胞系中进行 T 到 G 碱基编辑的能力，因此有望开发治疗由 G-C to T-A SNV 引起的疾病的药物。此外，DAF-TBE 的 T 到 C 编辑活性还可用于治疗致病性 C-G 到 T-A SNV。虽然 ABE 的 A to G 编辑活性也能纠正这类突变，但由于 PAM 限制和有限的编辑窗口，有效 sgRNA 的鉴定往往受到阻碍。DAF-TBE 的使用允许靶向互补链，从而提高了识别合适 sgRNA 的可能性。DAF-BE 的开发增强了碱基编辑的能力，从而推动了基础研究和潜在治疗应用的发展。
原文链接：1）https://doi.org/10.1038/s41467-024-50012-w
2）https://doi.org/10.1038/s41587-023-02050-w
总结
碱基编辑系统，包括单碱基和双碱基编辑器，通过饱和突变和功能突变实现蛋白质的智能设计和定向进化，推动了蛋白质功能改造的发展。通过非脱氨酶依赖的、基于工程化糖基化酶的碱基编辑策略，开发出各种新型碱基编辑工具，其具有高效的编辑效率和较低的脱靶水平，极大拓宽了碱基编辑工具的适用范围。未来，递送工具的开发也是关键，尤其是更安全，靶向性更强的工具。在基因治疗中，AAV虽然是常用的载体，但其承载量限制了碱基编辑器的应用。此外，非病毒载体如脂质纳米颗粒和类病毒载体虽有潜力，但递送效率需提高。在基因治疗中，递送工具需要兼具瞬时、高效、安全以及包容性强的特点，因此病毒载体的安全性问题和非病毒载体效率上的挑战使得递送系统仍需要进一步开发和探索。随着技术发展，新的碱基编辑工具将逐步进入基因编辑领域，推动其在基因治疗和农业中的应用。新策略与传统方法互补，共同突破技术瓶颈，发挥更大潜力。
文献引用
[1] Han D, Xiao Q, Wang Y, et al. Development of miniature base editors using engineered IscB nickase[J]. Nature methods, 2023, 20: 1029-1036.
[2] Xiao Q, Li G, Han D, et al. Engineered IscB–ωRNA system with expanded target range for base editing[J]. Nature Chemical Biology, 2024: 1-9.
[3] Yang L, Huo Y, Wang M, et al. Engineering APOBEC3A deaminase for highly accurate and efficient base editing[J]. Nature Chemical Biology, 2024: 1-12.
[4] Yi Z, Zhang X, Wei X, et al. Programmable DNA pyrimidine base editing via engineered uracil-DNA glycosylase[J]. Nature Communications, 2024, 15: 6397.
[5] Ye L, Zhao D, Li J, et al. Glycosylase-based base editors for efficient T-to-G and C-to-G editing in mammalian cells[J]. Nature biotechnology, 2024: 1-10.
本课题组常年全球招募具有化学材料、基因治疗、生物医学和生物信息等相关背景的副研究员、助理研究员、博士后和科研助理。
有意者请将简历发送至宋杰老师邮箱：jiegroup@126.com，或点击此处查看详情。
往期回顾
Nat Biomed Eng | 将单碱基编辑器装进单个AAV进行基因编辑
Nucleic Acids Res | AGBE系统：新型融合双碱基编辑器
Nucleic Acids Res | 可以自传递的化学修饰CRISPR RNA用于AAV协同传递和体内基因组编辑
