背景
01
构建含PC-linker的DNA光笼
这篇文章报道了一种基于DNA酶的光响应DNA四面体（PD-DT）的设计和构建（图1），将活性DNA酶直接组装到DNA纳米笼（TDN）的骨架中，在PD-DT的其中两条链引入光可裂解的PC-linker，光照致使DNAzyme释放，在Mg2+辅助存在下切割靶mRNA，从而实现对酶基因调控活性的光激活时空控制。实验结果证明，在四面体DNA支架中控制DNAzyme能够显著提高其稳定性，通过FRET设计验证了PD-DT在细胞内DNAzyme的光激活释放，监测MCF-7细胞中Survivin蛋白表达水平降低了一半，验证了光可作为该体系条件控制基因调控的有效工具。此外，为证明该方法的适用性，引入反义寡核苷酸（ASO）构建DNA四面体（PA-DT），验证了可光激活的DNA纳米结构可以作为条件控制基因调控的有效工具。
图1 基于DNA酶的光笼化和载体递送示意图
原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202404064
02
引入来源于天然植物的光敏蛋白
除了用加入PC-linker的光笼修饰蛋白质之外，来自植物的天然光响应蛋白质也被掺入到参与基因表达的蛋白质中。由于天然光敏蛋白吸收光的种类多，利用这一点，下面介绍的这个研究将其引入哺乳动物细胞中实现的多种光下不同的基因表达调控。
这篇文章首次验证了植物来源的光敏伴侣蛋白 FHL/FHY1可作为转录激活因子，通过与光敏色素ΔPhyA相互作用形成光敏转录调控复合物（PTRC），PTRC在红光或远红光激活下切换“活性”和“非活性”状态（图2）。在发色团藻蓝素（PCB）存在的情况下，暴露于红光会诱导ΔPhyA与FHL/FHY 1结合，产生光敏转录调节复合物（PTRC），抑制其转录激活功能。当暴露于远红光时，ΔPhyA从FHL/FHY 1解离，分解PTRC并解除靶基因的FHL/FHY 1转录激活。他们开发了一种光开关平台，设计了三种PTRC系统，分别在哺乳动物细胞和小鼠体内进行了实验验证：（1）将PTRC引入基于CRISPR介导的转录激活系统（PTRCdcas），可以调节内源性基因表达；（2）PTRC可以增强基于化学诱导邻近（CIP）的转录调控系统的可控性，通过用FHL取代原来的反式激活因子，开发了PTRCCIP系统，在红光照射下小分子诱导的靶基因可迅速终止表达；（3）将PTRC与蓝光响应隐花色素（CRY2-CIBN）系统组合，产生双波长光控转录调控系统PTRCDL，该系统可以分别通过蓝光或红光在体内实现“ON”或“OFF”。在调控基因表达方面，该系统具有高度适应性、灵活性和可逆性。
图2 PTRC介导的转录调控系统
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-49254-5
03
从哺乳动物细胞筛选光开关转录因子
目前已有许多不同的光感受器被用来控制基因表达，除了刚刚提到的光敏色素、隐花色素外，植物向光素的光氧电压（LOV）结构域也是常用的光感受器，它利用黄素核苷酸作为辅助因子形成加合物，在蓝光照射下释放Jα螺旋，有助于启动蓝光激活的反应。引入LOV结构域是一种很好的光开关策略，不过这种光遗传学工具的开发的难点在于：（1）由于插入位点或接头长度一点微小的变化也会明显地改变插入效果，因此难以选择LOV结构域的插入位点；（2）LOV结构域的插入可能会以多种方式改变蛋白质的活性，对分离的蛋白的结构进行分析可能无法很好地捕获到其中的许多变化。
针对以上问题，这篇文章提出的办法是，直接在哺乳动物细胞中进行光遗传学工具的筛选以建立文库。在文库的候选蛋白中的所有位点插入来源于燕麦的AsLOV2光开关结构域，随后将该文库引入哺乳动物细胞中进行表达，使用Gal 4-VP 64转录因子作为模型演示。依靠DNA免疫沉淀测序（DIP-Seq）和构建Landing pad系统这两项技术，实施筛选策略：先在无光照条件下选取高转录因子活性的细胞（高表达），然后在光照条件下挑选低转录因子活性的细胞（低表达）；经过3轮筛选，获得具有显著转录因子活性差异的细胞，并对光调控在时间上和空间上的精度做了研究，将该系统命名为LightsOut系统。其中S22-K23插入位点在有无光照条件下具有着显著的荧光差异，进一步发现AsLOV2结构域的插入位点多数在锌指结构的半胱氨酸附近，实验证明可以超出Zn2Cys6家族一般化到其他转录因子，如C2H2家族；且插入AsLOV2的linker长度对于光调控的影响很大，因此linker的小变动可用于调节光遗传学转录因子性能，使其能从初始插入位点快速优化。该系统的合理设计策略在发现和改进下一代光遗传学工具方面有很大的作用。
图3 在哺乳动物细胞中筛选构建文库
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-38993-6
04
掺入实现光酶控制基因表达的RNA基序
与上一篇文章一样，这篇文章同样使用了LOV结构域作为光感受器（NmPAL），NmPAL的C端LOV结构域被蓝光激活后，信号传输到ANTAR结构域改变结构，NmPAL就会与短RNA发夹结合并因此变得不可接近，进而控制基因表达。下文所设计的光调控系统利用的就是这样的原理。
这篇文章描述了一种通过SELEX筛选出的高亲和力结合NmPAL的RNA发夹——Motif 3，用它促进引入的光依赖性的适体酶变体optozymes（Oz）的作用。在这个研究中，将Motif 3嵌入锤头状核酶（HHR）的茎中，使得能够依靠光招募Oz，产生了具有5bp/4bp茎的OzS5/OzS4，将Motif 3与HHR结构域连接，嵌入编码EGFP的哺乳动物细胞mRNA的3'-UTR，通过蓝光控制核酶介导的3'-polyA尾切割，从而有效调节哺乳动物细胞和细菌中的基因表达。其中，在哺乳动物细胞中，OzS4表现出的调控更有效，在蓝光照射后能将基因表达抑制到近似背景水平；而且只有OzS4在增大或减小NmPAL浓度的情况下，显示切割活性随之升高或降低。NmPAL在OzS5切割后可能仍与mRNA结合，导致延迟降解；在OzS4中未观察到这种效应，他们将其归因于OzS4与NmPAL之间的相互作用强度低于OzS5。在证明Motif 3修饰的Oz能够实现哺乳动物细胞中基因表达的光调控后，将其引入设计的基于shRNA和CRISPR/dCas9系统中，表现出Motif 3作为合成生物学工具的广泛适用性，能够通过光对基因表达水平进行调控。
图4 哺乳动物细胞中光酶控制的基因表达系统
原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202304519
总结
利用光调控基因表达已经在无细胞系统到体内系统中出现了广泛的应用前景。总的来说，生物和化学两大类的光调控工具主要是：化学工具依赖于将光笼附着在核酸、小分子和蛋白质上，而生物工具则使用工程化的天然光敏蛋白。由于紫外线会损伤细胞，因此，研究吸收较长波长光的光笼就能减少产生的细胞损伤且组织穿透力更强，如红外光控制的光笼；而天然光敏蛋白吸收紫外可见光等多种光，因此，在引入光敏蛋白的情况下，即使在同一个细胞内，基因表达也可以受不同波长光的控制，就如本次专题分享的第二篇文献里实现的调控方式。在选择好合适的工具后，想要通过光调控实现有效的“开”和“关”，还需要对光调控系统内的一些小的部分进行优化，如插入位置、序列长度等。更长远地看，合理设计更有效、更通用的光调控基因表达系统，以及将光激活与递送相结合的可行方案，将推进以功能性DNA为基础的生物传感器的发展以检测或治疗疾病。
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