专题文献分享 | 噬菌体与细菌对抗中的“军备竞赛”研究以及工程化噬菌体治疗耐药菌

中国自古以来就有“相克相生”之说。在自然界中，生命体处于资源有限的环境中，为了生存与繁衍而互相对抗，从而促进了各自生命体的进化。其中噬菌体与细菌是对抗时间非常长久的一对生命体。在对抗中，细菌和噬菌体之间展现出了高强度的“军备竞赛”，使得细菌进化出强大的抵抗噬菌体感染的防御系统，而噬菌体也发展出了一套能够克服细菌防御的机制。对于人类而言，细菌是致病的病原体之一，人类也需要思考出好的方法对抗细菌的攻击。在本期的文献速递专题中，我们将介绍最近几篇研究噬菌体与细菌相互对抗中的一些关键分子与机制，并且也将介绍工程化筛选噬菌体对抗疾病的新策略。

在不断的进化过程中，细菌发展了一整套抵抗外源噬菌体与质粒的内在免疫系统，其中CRISPR-cas系统能够有效的保护噬菌体侵染。而噬菌体也进化出对抗CRISPR的方法，如噬菌体抗CRISPR基因（acr）在侵染后快速表达，从而能够逃避宿主的CRISPR-cas系统防御。Acr和Aca蛋白在acr-aca操纵子中共同编码，转录通过Aca二聚体与启动子中的反向重复序列结合而受到自我抑制，目的是降低过度表达acr导致的细菌在被侵染后的适应度，实现“温水煮青蛙”似的侵染。近期发表于Nature期刊上的文章《Phage anti-CRISPR control by an RNA- and DNA-binding helix–turn–helix protein》具体探究了这一调节过程，介绍了Aca2蛋白抑制Acr表达的新机制。

在本篇文章中，作者首先验证了Aca2（表达Aca蛋白的基因）是噬菌体ZF40所必须的。因为在Aca2缺失的情况下，仅含有acrIF8（表达Acr蛋白的基因）过表达载体表现出对细菌的毒性，而补充Aca2之后限制了这一毒性。随后利用噬菌体工程生产方法生产了Aca2缺失的噬菌体，并感染细菌。结果表明其噬菌斑数量显著减少。这表明Aca2对于控制ZF40噬菌体复制过程中acrIF8-aca2的表达至关重要。进一步创造多个具有改变的acrIF8–aca2基因座的噬菌体发现，acrIF8中过早的终止密码子不足以完全消除噬菌体繁殖对 Aca2 的依赖性。这表明 Aca2 在天然噬菌体环境中的另一个作用是限制不受控制acrIF8–aca2操纵子转录造成的有害后果（图1）。

图1 Aca2 减轻 acrIF8–aca2 操纵子的毒性 （来源于原文Figure 1）

为了探究Aca2如何实现对acrIF8-aca2的严格控制，作者检查了基因座的调控区域。发现Aca2能够结合acrIF8–aca2 mRNA上5’UTR的一个反向重复序列IR2与IR-RBS区域形成的两个茎环结构。而这一结合可以阻断核糖体进入RBS区，从而直接抑制后续的翻译过程。

深入探究Aca2与该区域的结合过程，作者进一步进行了冷冻电镜实验检测其复合物。结果显示Aca2能够形成二聚物与IR2与IR-RBS区域形成的两个茎环结构相结合。Aca2蛋白具有螺旋-转角-螺旋（HTH）结构域，该结构域能够使蛋白结合RNA双链更加类似于DNA双链，但与结合DNA仍有不同，其氨基酸组成和保守性凸显了基于 RNA 的调控的重要性。根据Aca2在DNA与RNA结合上与调节机制上的异同，作者提出了一个Aca2调节的回路（图2），表明Aca2在DNA转录水平（DNA结合）与mRNA翻译（RNA结合）过程中双重影响Acr蛋白的表达。双重 Aca2 控制不仅包含转录自身抑制的负反馈，还包含不连贯的前反馈回路，其中转录的 mRNA 同时产生 AcrIF8 和 Aca2，但 Aca2 仅阻止 acrIF8 的进一步翻译。建模和实验证明了 Aca2 的双重 DNA 和 RNA 结合特性如何实现最初高 Acr 爆发（以沉默 CRISPR-Cas作用），然后随着噬菌体 DNA 的积累而进行抑制和缓冲。最后，作者探究了这一机制的广泛性，发现双重转录和翻译控制在 Aca2 家族中广泛存在。

图2 Aca2的双重功能 （来源于原文Figure 5a）

总结而言，该研究发现了Aca蛋白的双重功能，它可以结合 DNA 和 RNA，使噬菌体在与细菌 CRISPR-Cas 系统的军备竞赛中能够产生适当的 Acr以沉默CRISPR-cas的作用，但同时也不会造成Acr过度产生导致的毒性。

除了CRISPR-Cas系统，还有一些其他方式能够使细菌防御噬菌体侵染，同时噬菌体也针对这些防御手段进行反击。近期一篇发表于Nature期刊的文章《Phages overcome bacterial immunity via diverse anti-defence proteins》发现了噬菌体中四种不同的对抗防御蛋白家族，它们能够抑制细菌中目前已知的 Gabija、Thoeris 和 Hachiman 防御系统。

在此前的研究中发现，通过分析基因组相似但对细菌免疫表现出不同敏感性的噬菌体，可以发现噬菌体中对抗细菌防御系统的特异性蛋白。因此在此作者分离并分析了几组密切相关的噬菌体，并测试了它们对几种保护芽孢杆菌免受噬菌体感染的防御系统的敏感性。选取SBSphiJ 样、SPβ 样和 SPO1 样噬菌体，并分别感染五种具有独立防御系统的菌种（这五种菌株表达 Thoeris、Hachiman、Gabija、Septu 和 Lamassu 各一种防御系统），通过基因组比对发现关键分子（分析流程见图3）。

图3 通过噬菌体基因组比对发现对抗细菌不同防御系统的关键分子（来源于原文Figure 1）

分析发现，gad1基因的存在能够对抗Gabija防御系统，而敲除之后难以克服Gabija的防御。然而，噬菌体 SPβL6 和 SPβL7，它们缺乏gad1，但仍然对 Gabija 有部分抗性，这些噬菌体在其他噬菌体中编码gad1 的同一基因座上编码了另一个功能未知的基因。它编码400个氨基酸的蛋白质，作者称之为gad2。敲除该基因使噬菌体SPβL7对Gabija完全敏感，而结构预测表明gad2可能是一种具有核苷酸转移酶蛋白结构域的酶。

同样的方法，作者发现了噬菌体对抗另一细菌防御体系Thoeris 的基因tad1，这是一种 1″–3′ gcADPR 海绵。Tad2 是一种短蛋白质（89 aa），含有 DUF2829 蛋白质结构域。通过生化实验与结构解析手段可以得知，Tad2并不是一种切割蛋白质的酶，而是通过特异性结合和隔离 1″–3′ gcADPR （Thoeris防御系统主要的激活信号分子）来拮抗 Thoeris 防御系统。

进一步利用相同方法筛查到噬菌体对抗Hachiman 防御系统的关键分子Had1。Had1 是一种 53 个氨基酸的短蛋白，与任何已知功能的蛋白均无序列同源性。作者确定了Had1的结构，发现该蛋白是一个同源二聚复合物。Had1 二聚体复合物中心的带正电荷的斑块可能意味着 Had1 可能保护噬菌体复制中间体不被 Hachiman 系统识别，但目前具体的机制尚不明确。

总结而言，作者开发了一种能够筛查噬菌体对抗细菌防御系统的关键蛋白的方法，并发现了当这些蛋白质 Gad1、Gad2、Tad2 和 Had1在对抗不同防御系统的过程中发挥着重要的作用。这些结果也说明了噬菌体编码了一系列抗防御蛋白，通过多种对抗手段进行对细菌防御机制的破坏。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-023-06869-w

在侵染过程中，噬菌体必须夺取宿主基因表达的控制权才能复制，这一过程必须要迅速才能使噬菌体立于不败之地。目前对噬菌体侵染后立即靶向宿主转录和翻译的机制尚不明确，近期发表在Nature microbiology的文章《Phage proteins target and co-opt host ribosomes immediately upon infection》揭示了一种丰富且保守的噬菌体因子 ΦKZ014在噬菌体侵染过程中的重要作用。

为了系统地鉴定与宿主基因表达相互作用并破坏宿主基因表达的噬菌体蛋白，作者在此使用了梯度分馏技术与测序和蛋白质组学相结合的技术（Grad-seq，图4）。该方法基于通过经典甘油梯度分离细胞裂解物来预测分子复合物，然后进行高通量 RNA 测序（RNA-seq）并对各个梯度部分进行质谱（MS）分析。根据噬菌体ΦKZ侵染铜绿假单胞菌时间的不同依次取10 分钟、20 分钟和 30 分钟的细菌裂解产物进行分析。分析表明，噬菌体蛋白与铜绿假单胞菌的关键基因表达复合物有关，即RNAP和小（30S）和大（50S）核糖体亚基。从不同侵染时间取样的RNA测序结果中得知，噬菌体 mRNA 表达非常迅速，10 分钟后占所有编码转录本的 ~40%。最丰富的转录本包括几种编码核糖体部分中存在的蛋白质的转录本，例如 ΦKZ014、-105 和 -216。重要的是，这些 mRNA 的积累速度比编码 nvRNAP 亚基、噬菌体核壳蛋白 ChmA 或纺锤体蛋白 PhuZ 的转录本更快，这表明 ΦKZ 在早期宿主接管过程中对核糖体的靶向性具有很高的优先级。

图4 梯度分离噬菌体侵染后细胞裂解液中的蛋白（来源于原文Figure 1）

随后作者重点关注了ΦKZ014蛋白，因为这种蛋白质的同源物存在于许多 ΦKZ 相关噬菌体中。蛋白水平的检测表明，这种蛋白质早在感染后 5 分钟就可以被检测到。生化实验证实了 ΦKZ014 靶向 50S 亚基，并且相互作用可能发生在核糖体亚基间位点之外，与转录本或新生链mRNA无关。

为了明确其分子的作用机制，作者进一步通过冷冻电镜解析结构（图5）。发现ΦKZ014 占据了中央突起处的50S 核糖体亚基，该区域促进了各种功能性核糖体位点之间的通讯。中央突起的主要成分是 5S rRNA，它对于有效翻译至关重要。ΦKZ014 夹住 5S rRNA 的末端并通过基于电荷相互作用与其作用。结构解析的数据表明，ΦKZ014 与大核糖体亚基的直接相互作用，并表明 ΦKZ014 可能通过调节 5S rRNA 或 A-位点-指螺旋（ASF，rRNA中的一个结构）的茎在翻译中发挥作用。

图5 冷冻电镜解析ΦKZ014复合物结构（来源于原文Figure 5c）

此后为了探究 ΦKZ014 在感染环境中的功能，作者破坏了噬菌体基因组中的该基因，并比较有无ΦKZ014对蛋白合成的区别。发现删除ΦKZ014后，观察到整体蛋白质模式发生了一些变化，表明 ΦKZ014 对蛋白质合成具有调节作用，ΦKZ014 缺陷型噬菌体感染也会停止。此外，还观察到感染缺失ΦKZ014噬菌体后的前 2.5 分钟内从头蛋白质合成减少，然后在 40 分钟内逐渐停止。

总结而言，ΦKZ014 是感染后最早表达的噬菌体蛋白之一，对某些假单胞菌菌株中的噬菌体繁殖很重要。它可能以不同的方式发挥作用，例如通过直接调节翻译以确保噬菌体转录本的最佳翻译，或通过阻碍在核糖体处激活或靶向核糖体的细菌应激反应。总之在感染的初期，ΦKZ014在噬菌体与细菌争夺转录权的过程中，发挥了重要作用。

对于噬菌体的研究，除了探究其侵染与对抗防御的机制外，工程化噬菌体治疗耐药菌也是目前人们关注的一个方向。目前抗生素滥用的情况愈演愈烈，每年因抗生素耐药而死亡的人数约为70万人。因此寻找到对抗耐药菌的方法迫在眉睫。近期在Nature communications期刊发表了一篇文章《High throughput platform technology for rapid target identification in personalized phage therapy》，在这篇文章中，作者开发了高通量快速筛选抗耐药菌噬菌体的方法，为噬菌体治疗耐药菌提供了新的思路。

传统的噬菌体疗法中的抗耐药菌噬菌体依靠分离耐药菌、噬菌体库筛选与斑点测试等流程化步骤获得，耗时且费力。此外，目前不存在通用的噬菌体库，各个地区、区域的噬菌体库有限，成功实施个性化噬菌体疗法需要各区域之间的沟通与共享，因此也更需要稳定便携的检测手段。而快速、可靠、高通量并且便携的筛选方法是目前追求的目标。在此，作者设计并构建了一个治疗性噬菌体库，其物理形式为稳定且被全部包裹的固体片剂，每片片剂都封装一个噬菌体，并能够通过生化手段检测噬菌体侵染后的细胞裂解液（图6）。

图6 筛选对抗耐药细菌噬菌体的流程与表征（来源于原文Figure 1）

具体而言，噬菌体成功侵染细菌后，细菌裂解液中的ATP能够释放出，通过加入ATP检测试剂进而测量生物发光信号进行对噬菌体侵染程度的表征。在此，作者设计了“一锅法”生物化学方法进行高通量检测噬菌体感染，可检测到信号在感染后约 30 分钟出现，并在 60 分钟达到峰值。一锅法不仅可以区分未感染和感染的培养物，而且即使在最初较低的噬菌体滴度下，也可以区分不同噬菌体溶解活性。

为了解决解决生理温度下酶的快速失活问题，作者将普鲁兰多糖（生物分子的热保护作用）和海藻糖（对病毒有干燥保护作用）加入到混悬液和冻干ATP检测试剂混合物中。添加糖不会显著影响峰值生物发光信号且生物发光稳定。进一步将糖混合物干燥并制备成片状，包裹在糖聚合物基质中能够提高长期储存的稳定性。利用这一套筛选方法，作者进一步探究了对不同耐药菌临床分离株的噬菌体筛选。数据表明，全包固体片剂形式能够快速筛选噬菌体库中的能够对抗多重耐药分离株的噬菌体，具有高信噪比和可靠性，可与金标准培养技术以及代谢测定相媲美。

总结而言，该方法响应时间更快、与高通量实施兼容以及环境稳定性，无需冷链或特殊包装。能够有效地应用在噬菌体治疗中的快速筛选中。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-49710-2

在噬菌体与细菌的对抗中，噬菌体与细菌相互博弈，不断进化，演化出丰富的对抗与防御手段，扩大自己的“军备”。细菌不单单通过CRISPR-cas途径，也会通过其他途径进行防御。而噬菌体也会针对这些途径寻找突破口，以提早掌握在侵染后进行复制与转录的控制权。这些博弈手段目前仍然在探索中，还会有更多武器装备有待被发现。由于这样的“相生相克”的存在，噬菌体也可以被我们利用于对抗多药耐药细菌。尽管人类没有办法像噬菌体一样不断进化自身对抗细菌的“武器装备”，但“君子性非异也，善假于物也”，聪明的人类能够通过工程化筛选方法寻找到能够对抗耐药细菌的噬菌体，利用噬菌体进行对耐药菌的治疗，以丰富人类自身的“武器装备”。