文献速递 | 位点特异性转座相关研究

背景

CASTs系统（CRISPR-associated transposons）系统是一类结合了CRISPR-Cas引导能力的转座子系统，可以利用CRISPR RNA（crRNA）引导的效应复合体来实现对特定DNA序列的识别和靶向。目前，CASTs系统可以分为两大类：type-I CASTs：与Tn7转座子高度相关，使用Cascade效应复合体和gRNA来靶向转座；type-V CASTs：源自不同的Tn5家族转座子，使用Cas12k作为独立的效应蛋白。CASTs系统的一个关键特点是它们能够利用宿主中的防御相关CRISPR阵列进行水平基因转移，这使得CASTs能够在不同的细菌宿主中传播，并且可以被工程化用于特定的基因编辑任务。对于CASTs工作机制的理解一直是研究的热点之一，以下几篇文献着重介绍了CASTs进行转座的分子策略。

1. AAA+ ATP 酶激活转座酶

2024年6月，James M. Berger和Ernesto Arias-Palomo教授于Nature发表工作Molecular basis for transposase activation by a dedicated AAA+ ATPase，使用IS21作为模型转座酶系统，展示了ATP酶调节因子如何使用核苷酸控制的组装和DNA变形来实现基于结构的位点选择性、转座酶募集以及激活和整合。对于解释AAA+ATP酶调节因子如何重塑其底物DNA以促进转座有极大的帮助。

许多转座酶依赖于专用的AAA+ATP酶亚基调节位点选择性和催化功能。

IS21编码两种必需的蛋白质，IstA和IstB。IstA转座酶具有两个螺旋-转角-螺旋（HTH） DNA结合域，一个DDE催化基序和一个β桶，后面是一个灵活的羧基末端区域。IstB是AAA+家族的成员，与MuB、TnsC辅助蛋白类似，可以支持IstA进行DNA转座。利用此模型可以揭示Tn7和类Tn7转座家族编码的ATP酶如何执行“分子开关”的功能。

Figure 1

研究人员利用冷冻电镜进行研究，确定了IstB与DNA结合在ATP存在下复合物结构。cryo-EM结构显示IstB利用其N端域形成二聚体，通过ATP依赖的AAA+域相互作用寡聚成二对称十聚体，进而生成一个U形通道介导目标DNA双链弯曲，成为与IstA转座酶之间的桥梁。而且还保持AAA+ATP 酶域处于不活跃状态，稳定结合的DNA同时阻止无用的ATP水解循环。

另一方面，IstA转座酶配对并切割转座子末端以生成两个自由的3’OH基团。然后酶催化一个亲核攻击，将供体分子整合到目标双链中，结果是一种被称为链转移复合物（STC）的DNA产物。Fig.1展示了IstA-IstB-STC的构像。通过IstA、IstB和DNA的相互作用形成了STC，这是理解转座机制的关键。

在前转座状态下，IstA自组装成一个高度交织的四聚体，其中每个单体与所有伴侣亚基相互作用，使两个供体DNA分子以右手超螺旋结合。当IstB存在时，转座酶与目标双链建立新的相互作用，重新塑造了转座酶四聚体，诱导整合酶域的大规模旋转，以形成转座的适当间距和几何形状。它还在转座酶的上部单体中引起剪刀般的动作，破坏IstB结合前形成的蛋白质-蛋白质接触，从而解开了IstA在前转座切割供体复合物中稳定的DNA超螺旋。Fig.2展示了IstA与IstB和目标DNA的相互作用引发转座酶的构象变化过程。

Figure 2

该篇文章高分辨率地揭示了AAA+ ATP酶如何通过控制核苷酸组装和DNA变形来激活转座酶。由IstB ATPase自组装成一个特定的十聚体结构，并且这个结构通过弯曲DNA和与转座酶IstA的特定相互作用来促进转座反应。这些发现有助于解释AAA+ ATP酶如何在不同的转座系统和DNA复制系统中发生作用。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07550-6

2. Tn7转座酶家族的逐步组装过程

同时间，Alba Guarne教授于Molecular Cell发表工作Assembly of the Tn7 targeting complex by a regulated stepwise process，通过TnsD的TniQ结构域的冷冻电子显微镜（Cryo-EM）结构揭示了TnsD是TnsC的核苷酸交换因子，并通过一种可调节的、逐步的机制组装靶向复合物，为理解Tn7转座子的调控机制提供了新的视角。

Tn7转座子家族靶向整合依赖于专用的靶标选择蛋白TniQ和AAA+ATP酶接头蛋白TnsC在特定靶位点募集和激活转座酶。本工作报道了TnsD的N端结构域（TnsD^NTD）的各种功能：

1. 以序列非依赖但长度依赖的方式结合DNA，并且在结合时对DNA造成弯曲。这种DNA的弯曲对于后续TnsC的招募和转座复合体的组装至关重要；

2. 能够以ATP依赖的方式促进TnsC寡聚化，使TnsC逐个组装；

3. TnsD^NTD作为核苷酸交换因子，促进TnsC从ADP向ATP的交换，有利于TnsC七聚体环的形成，进而继续组装转座复合体。

作者通过冷冻电镜分析结构完整解释了Tn7转座复合物的组装过程。如Fig.3的图解所示，首先，与DNA结合的TnsD（紫色）招募TnsC的ADP结合二聚体。TnsC逐个募集促进了近端TnsC的C末端区域的重新定位和核苷酸交换，以及远端的同时释放。ATP结合的TnsC招募一个额外的二聚体（4：1complex），循环重复直到受限于空间位阻形成完整的环，为DNA的切割和插入提供了结构基础。作者解释道，不同的TnsC单体通过其特异性核苷酸结合状态执行不同功能：与TnsD 结合（TnsC1），促进转座免疫（TnsC3-7），以及招募转座酶TnsAB（TnsC6-7）。通过将靶点选择和转座酶募集功能分配到开环的两端，TnsC可以在靶点和插入位点之间施加严格的间距。因此可以实现对转座方向性和免疫性的控制，避免反向和重复插入。

Figure 3 TnsD/ TniQ介导的Tn7靶向复合物组装模型

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.05.012

3. I型和V型CAST进行水平转移的不同策略

2024年7月，Ilya J.Finkelstein教授团体于Nature Communications发表工作Distinct horizontal transfer mechanisms for type I and type V CRISPR-associated transposons，使用大肠杆菌定量转座测定和体外重建，作者表明CASTs可以使用来自宿主防御系统的CRISPR-RNA，并且有助于将CASTs移植到异源细菌宿主。

CASTs使用CRISPR相关蛋白和Tn7家族转座子进行RNA引导的垂直和水平转移。野生CASTs编码最少的CRISPR阵列，无法获得新的间隔区。作者进行生物信息学分析，发现CASTs与防御相关的CRISPR系统共存，尤其是I-B型和V型CAST亚型。接下来进行的定量接合转位实验表明，类型I-F、I-B和V型CASTs可以像利用内源间隔区一样有效地使用来自异源宿主的防御相关CRISPR系统的crRNAs。

作者使用冷冻电镜（Cryo-EM）解析了I-F型CAST-Cascade与III-B型CRISPR RNA的复合体的高分辨率结构。结构显示Cas6通过序列无关的π−π相互作用识别直接重复序列（DR）(Fig.4左)。此外，研究还发现DR必须包含一个5bp的茎和一个5nt的环结构稳定活性(Fig.4右)，以实现有效的转座。

Figure 4 使用异源CRISPR RNA时不依赖序列而依赖结构

除了使用异源CRISPR阵列外，V型CASTs还可以通过无引导机制进行转座。删除crRNA，V型CASTs仍然能够进行非特异性的转座。使用过表达S15辅因子和tracrRNA或单一gRNA等增加特异性的方法可以减少但并不能完全消除V型CASTs的非靶向整合。这一发现表明V型CASTs在水平转移中可能存在额外的机制（Fig.5）。

综上所述，这项研究揭示了CASTs可以利用异源CRISPR阵列进行水平转移，对CASTs转移至异源细菌宿主的需求有重要意义。更广泛地说，这项工作将指导未来对CASTs进行工程化改造，以优化其在不同生物中的基因编辑活性和特异性。

Figure 5 I型和V型CASTs水平转移的双重策略。两种系统都可使用归巢间隔区（紫色）进行垂直转移

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-50816-w

Pong转座系统是一类在水稻中发现的DNA转座子系统，由两个主要的蛋白质组成：ORF1和ORF2。ORF1是一个Myb类DNA结合蛋白，能够识别并结合到转座子的末端反向重复序列（TIRs），而ORF2则是具有DDE催化基序的典型转座酶，负责转座子的切除和插入。研究表示，在切除过程中，转座子DNA从供体位点被切除，并在转座酶的保护下，被精确地插入到基因组的新位置。Pong转座系统的优势在于其高度的位点特异性和对DNA的保护作用，这使得它在植物基因组工程中具有巨大的应用潜力。

2024年5月，R. Keith Slotkin教授团体于Nature发表工作Transposase-assisted target-site integration for efficient plant genome engineering，开发了一种基因组工程工具转座酶辅助的目标位点整合（TATSI）系统，利用TE精确切除和插入基因组的能力，可以控制转座因子TE插入位点和货物基因。

Figure 6 转座酶和可编程核酸酶的联合活性导致靶向插入

实验中，受细菌中以可编程方式靶向转座的CRISPR相关转座酶（CASTs）的启发，如Fig.6所示，作者将水稻Pong转座酶蛋白ORF1、ORF2与Cas9或Cas12a可编程核酸酶融合，并在拟南芥中进行了转化。发现融合蛋白能够介导mPing转座子从供体位点的切除，并在CRISPR gRNA指导下，将转座子精确地插入到目标基因位点。通过PCR和Sanger测序，验证了mPing转座子在目标位点的整合，并通过深度测序分析了整合位点的精确性。结果显示，融合降低了转座酶活性，但也增加了靶向插入的比率。大多数整合事件发生在CRISPR切割位点或其附近，且mPing转座子的插入通常是完整的，表明转座子蛋白在转座过程中保护了DNA免受核酸酶的降解。

接着，作者测试了TATSI系统的靶向整合效率和特异性。发现与现有的目标位点整合技术 HR、HDR 或 NHEJ 相比，TATSI系统在拟南芥中实现了更高的靶向整合频率和准确性。此外，作者还证明了TATSI系统能够携带更大的DNA片段（Fig.7），将增强子元件、开放阅读框和基因表达盒（如抗除草剂双磷基因bar）等的序列特异性靶向插入到模式植物拟南芥的基因组中。

Figure 7 插入位点和插入序列的可编程性

最后，作者证明可以将TATSI技术应用到大豆中。实验结果表明，TATSI系统能够实现mPing转座子的靶向整合，并且能够携带并整合bar等货物基因(Fig.8)。将TE从“寄生虫”设计成一个可用的工具箱，能够将定制DNA序列特异性靶向植物基因组。

综上所述，这项研究开发了一种新的植物基因组编辑工具TATSI，通过融合转座子蛋白和CRISPR核酸酶。这一技术在模式植物拟南芥和大豆中均显示出高效性和准确性，并具有携带较大DNA片段的能力，为植物基因组工程和作物改良提供了新的策略。作者认为，靶向插入的限制因素是TE切除率，随着技术的进一步优化，TATSI系统的靶向整合效率将在未来几年内得到提升。

Figure 8 大豆基因组中的靶向插入

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07613-8