专题文献速递 | miRNA的检测与调控的近期进展

背景

原文链接: https://www.nature.com/articles/nrd.2016.246

在疾病诊断方面，特定的miRNA表达模式可以作为生物标志物，用于癌症、病毒感染等疾病的早期检测和诊断。例如，某些miRNA在特定类型的癌症患者的血清或组织样本中的表达水平会显著变化，通过精确检测这些miRNA，可以帮助医生评估疾病状态，甚至预测疾病发展。

miRNA在体内的含量较低，且分子间同源性高，这给检测带来了挑战。滚环扩增（RCA）是一种有前景的核酸检测技术，通过特定的挂锁（Padlock）探针形成循环模板进行信号放大，但传统的挂锁探针在特异性和灵敏度方面存在不足。

挂锁探针是一段包含两个末端识别区域和中间功能区域的线性DNA序列，在传统挂锁探针的基础上，作者开发了双端茎环挂锁（Dual-Terminal Stem-Loop Padlock, DSLP）探针。在两端的识别区域设计了两个茎环结构（Stem-Loop A和Stem-Loop B）。当目标miRNA存在时，miRNA会与挂锁探针的两个茎环结构的环部分杂交，触发链置换反应，打开茎环结构。随后，挂锁探针的两个末端在miRNA的作用下靠近并被连接酶（ligase）连接成一个环形DNA分子。环形DNA分子作为RCA的模板，被特定的DNA聚合酶识别并开始扩增反应，生成大量单链DNA。扩增的DNA可以进一步与功能性的探针结合，如与荧光标记的探针结合，用于信号的放大和检测。扩增产生的单链DNA可以通过多种方式输出信号，例如形成G四链体结构、与酶如辣根过氧化物酶（HRP）结合产生颜色变化，或者通过荧光共振能量转移（FRET）等方式产生可检测的荧光信号（图2, ACS nano, 2024）。与传统挂锁探针相比，新设计的双端茎环挂锁（DSLP）实现了更好的单碱基错配识别能力，并且检测灵敏度提高了1000倍以上。通过分子动力学模拟阐明了DSLP设计的机制，证明了其在提高检测性能方面的有效性。DSLP设计不仅针对特定的miRNA，而且通过改变目标识别区域，可以应用于多种miRNA的检测，包括癌症患者的临床样本检测。

第二个工作作者开发了一体式等温EXTRA-CRISPR探针。设计一个包含两个部分的挂锁探针：一个用于目标miRNA的识别区域，和一个用于Cas12a酶识别的区域。Padlock探针在设计时，使其在没有目标miRNA存在时保持线性，无法被Cas12a酶切割。当目标miRNA存在时，它会与挂锁探针的识别区域结合，触发探针的环化过程。通过特定的连接，挂锁探针的两端被连接起来，形成一个闭合的环状DNA分子。环状DNA分子作为RCA的模板，由phi29 DNA聚合酶等温扩增，生成长链的线性DNA。这个长链线性DNA分子包含多个重复的Padlock探针序列，可以作为Cas12a酶的切割靶点。Cas12a的双重切割活性。顺式切割活性：Cas12a酶可以特异性地切割与目标miRNA结合的环状DNA分子，生成多个短的线性DNA片段。反式切割活：激活的Cas12a酶还能非特异性地切割添加到反应中的荧光标记的单链DNA（ssDNA）报告分子，产生荧光信号。由于Cas12a的顺式切割活性，生成的短线性DNA片段可以作为新的RCA模板，触发更多的RCA循环，实现目标miRNA的指数级扩增。同时，Cas12a的反式切割活性导致荧光报告分子的切割，产生可检测的荧光信号，实现对miRNA的高灵敏度检测。整个检测过程在恒定的温度下进行，不需要复杂的热循环步骤，简化了操作流程。该方法能够快速产生结果，并且可以通过智能手机等便携设备进行检测，提高了检测的可及性和便捷性（图3, Nat. Biomed. Eng., 2024）。通过这种设计，一体式等温Cas12检测miRNA的方法能够在不需要复杂仪器和多步骤操作的情况下，实现对miRNA的高灵敏度和高特异性检测，为疾病诊断和生物医学研究提供了一个强大的工具。

图3 一体式等温EXTRA-CRISPR探针工作原理

miRNA可以被设计成生物传感器，用于检测和响应特定的生物分子或环境条件，从而实现对基因表达的可编程控制。

细胞状态转换在自然、病理和人为引导过程中发挥着关键作用，包括细胞分化、衰老、肿瘤发生、细胞编程和重编程等。精确控制细胞状态转换对于疾病治疗和再生医学具有重要意义。

Ron Weiss团队开发了Low miRNA传感器（Low miRNA Sensor，简称LmS）和High miRNA传感器（High miRNA Sensor，简称HmS）两种基于miRNA的基因工程传感器。Low miRNA传感器（LmS）：用来检测细胞内miRNA水平较低的情况。它通常包含一个感兴趣的基因（Gene of Interest，GOI），并在该基因的5'和/或3'非翻译区（UTR）中嵌入多个与特定miRNA反向互补的序列。当目标miRNA水平较低时，这些miRNA序列不会与miRNA结合，因此GOI得以正常表达。当目标miRNA水平升高时，miRNA会与这些序列结合，通过RNA干扰机制抑制GOI的表达。High miRNA传感器（HmS）：用来检测细胞内miRNA水平较高的情况。它利用CRISPR特异性的核糖核酸酶（endonuclease，简称ERN）作为中介，通过两步转录后去抑制策略来调控GOI的表达。在HmS中，GOI的表达受到一个转录后抑制子（即ERN）的调控，而这个抑制子又受到内源miRNA的调控。当miRNA水平较低时，miRNA不会与抑制子的mRNA结合，抑制子得以表达并切割GOI的mRNA，导致GOI表达受到抑制。当miRNA水平较高时，miRNA会与抑制子的mRNA结合并将其降解，从而解除对GOI的抑制，使得GOI得以表达。HmS通过这种方式建立了内源miRNA活性与GOI表达之间的正相关关系。这一方法被用于监测多种细胞状态转换，以内皮细胞作为中间状态自动引导人类诱导多能干细胞（hiPSCs）向血液谱系分化（图4, Nat. Biomed. Eng., 2024）。

该技术展现出持久性，并能抵抗表观遗传沉默，为生理和病理条件下细胞状态转换的监测提供了新的工具，并为器官类疾病建模、细胞治疗和再生医学中的应用提供了可能。

核酸分子在生物流体中作为疾病诊断的新兴生物标志物具有重要价值，但其临床应用受到检测技术灵敏度限制。传统的核酸检测方法如qPCR需要严格的样本处理和昂贵的仪器设备。尽管已有多种等温扩增技术被开发，但它们存在操作复杂、易受污染、需要昂贵酶类等缺点。因此，开发一种高灵敏度、高特异性、操作简便且成本效益高的核酸生物标志物检测方法对于临床分子诊断具有重要意义。本研究报道了一种新型的核酸检测技术，名为SPOT（sensitive loop-initiated DNAzyme biosensor for nucleic acid detection。SPOT由一个单链DNA组成，包含一个完整的催化核心和两个完全封闭的侧翼臂。在两个锁定域之间集成了一个单链环，作为别构模块用于核酸的识别和检测。在没有目标核酸时，SPOT保持在锁定构象，其侧翼臂通过延伸的5'端自我折叠并与锁定域结合，阻止底物结合，但不干扰催化核心。当miRNA与SPOT的检测环结合时，形成的双链DNA刚性结构在两个锁定域之间引入机械张力，导致锁定域热力学不稳定，从而打开DNA酶的结构，暴露出底物结合位点。一旦DNA酶结构打开，底物分子就可以连续地结合并被DNA酶切割，产生荧光信号放大（图5, Angew., 2024）。这种荧光最初由于邻近的荧光猝灭剂而受到抑制。该技术为低丰度核酸的检测提供了一个稳健的平台，具有操作简便、成本效益高的优点，并已在临床样本中验证了其对多种癌症的诊断潜力以及对SARS-CoV-2 RNA的高灵敏度和特异性检测。

图5 SPOT概述

在疾病治疗方面，miRNA的调控潜力被用于开发新型疗法。通过设计能够特异性结合并抑制或激活特定miRNA的分子，可以干预疾病的分子机制，为治疗提供新策略。例如，通过使用人工设计的酶或RNA分子来特异性降解与疾病相关的miRNA，可以抑制病毒复制或抑制肿瘤生长。

RNA干扰（RNAi）是一种强大的工具，可在治疗和研究应用中实现特定基因的敲低。然而，为了降低非特异性靶向、潜在毒性，并允许靶向必需基因，需要对RNAi进行时空控制。本研究描述了一类新设计的RNA开关，能够在哺乳动物细胞中实现RNAi的序列特异性调控。

研究者们开发了一种条件性RNAi系统，称为由触发RNA诱导的正交RNA干扰（ORIENTR），该系统通过使用顺式抑制RNA元素，只有在与相应的触发RNA结合时才启动miRNA的生物发生。ORIENTR的设计基于cis调控RNA元件，控制Microprocessor复合体的识别，从而有条件地启动miRNA的生物合成。在没有触发RNA的情况下，条件性pri-miRNA采用一种非活性的二级结构，阻止Microprocessor的识别。通过与特定的触发RNA结合，ORIENTR可以感应内源性mRNA表达的波动，并有条件地触发针对内源基因的amiRNA生物合成（图6, Nat. comm., 2024）。ORIENTR系统提供了高达14倍的人工miRNA生物合成增加，并与dCas13d结合后动态范围可提高至31倍。此外，ORIENTR可以应用于检测内源性RNA信号和条件性敲低内源性基因，从而实现包括细胞类型特异性RNAi和通过RNA轮廓重构转录网络的调控可能性。

原文链接: https://doi.org/10.1038/s41467-024-50600-w

传统的酶工程方法在设计具有特定底物结合特性的酶时面临挑战，特别是产品抑制问题，这限制了酶的催化循环和实用性。因此，开发一种新型的、能够特异性切割siRNA和miRNA的酶，不仅能够为研究这些小RNA分子的功能提供新的工具，还有望在治疗相关疾病方面展现潜力。

加拿大渥太华大学John Paul Pezacki研究团队利用遗传密码扩展技术，成功创建了一种非天然的内切核酸酶，该酶能够特异性地切割非编码RNA（包括短干扰RNA siRNA和微小RNA miRNAs），这一功能在自然界中是不存在的。研究团队在病毒RNA沉默抑制蛋白p19中引入了一种金属螯合非天然氨基酸(2,2′-联吡啶-5-基)丙氨酸（BpyAla），使其在结合铜离子后能够显示出对siRNA和人类miRNAs的催化特异性切割。通过荧光偏振和荧光开启等方法确认了催化作用。全球miRNA分析显示，这种工程酶能够在人类细胞系中切割miRNAs。研究还展示了通过靶向对丙型肝炎病毒（HCV）至关重要的宿主因子miR-122，非天然内切核酸酶功能的治疗效果（图7 Nat. comm., 2024）。

这项研究不仅展示了合成生物学在开发新型生物分子工具方面的潜力，也为未来针对特定RNA分子的治疗策略提供了新的思路。

图7 非天然的内切核酸酶工作机制图

原文链接: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39105-0